[发明专利]一种胰高血糖素的制备方法

权利要求书

1.一种合成胰高血糖素的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：

步骤1)按照胰高血糖素氨基酸序列C端到N端的顺序，在偶联试剂的作用下利用固相合成法逐个连接5-29片段，得到H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂；

步骤2)将四肽片段Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，脱除Fmoc保护后，得到H-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂，或者，将四肽片段Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，得到Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂；

步骤3)将步骤2)得到的树脂酸解脱除保护基及切肽得到胰高血糖素粗品；

步骤4)将步骤3)得到的胰高血糖素粗品经制备液相色谱纯化，得到纯化品；

步骤5)将步骤4)得到的纯化品冻干后得到胰高血糖素的纯品，完成合成。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)合成5-29肽树脂片段使用的树脂为Wang树脂，其初始肽树脂Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂取代度为0.2～0.5mmol/g。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中，N端偶联有保护基的Thr(tBu)和Wang树脂的比例为1-6:1。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤1)和步骤2)中，每次延伸偶联时所述氨基酸和对应肽树脂的摩尔比为1-6:1。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中，1-4片段主链氨基采用Fmoc或Boc保护，His采用的侧链保护基为三苯甲基，Ser采用的侧链保护基为叔丁基，Gln采用的侧链保护基为三苯甲基。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤1)中，所述偶联试剂为HOBt，HOAt与DIC的混合物，或PyAop、PyBop与有机碱的混合物，或HBTU、HATU与有机碱的混合物；所述有机碱选自DIPEA、Et₃N、NMM中的一种或多种混合。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，在步骤1)中，所述偶联试剂为HOBt与DIC的组合。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述有机碱为DIPEA、Et₃N或NMM中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述偶联的反应溶剂采用DMF。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，脱侧链保护基及切肽中所用的裂解试剂为三氟乙酸与茴香硫醚、苯甲醚、三异丙基硅烷、苯酚、1,2-乙二硫醇或水其中一种或几种的组合。