[发明专利]一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法

说明书

本发明公开了.一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，通过在2g样品当中加入2.5ml缓冲液、0.25ml SR1溶液、0.8ml SR2溶液以及0.19‑0.21g PVPP干粉后涡旋混匀后分层和进一步的前处理后得到RNA沉淀进行后续测序。本发明可以有效解决获得的RNA存在DNA残留的问题，提升RNA前处理的处理精度。

技术领域

本发明涉及宏转录样品前处理领域，具体涉及一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法。

背景技术

现有的样品前处理方法当中，并不能有效解决获得的RNA存在DNA残留的问题，而DNA残留会导致RNA的提取精度低，且容易对后续的测序造成影响。

因此如何有效解决DNA的残留问题，是如果有效提升RNA前处理的处理精度的关键所在。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法。该方法能有效降低DNA残留。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，包括如下步骤：

步骤一：在2g样品当中加入2.5ml缓冲液、0.25ml SR1溶液、0.8ml SR2 溶液以及0.19-0.21g PVPP干粉后涡旋混匀；

步骤二：加入3.5ml细胞裂解液后涡旋至分离层消失；

步骤三：以3100-3300rpm的转速涡旋震荡10-20min，后在室温条件下以2400-2600g的速度离心9-11min后转移第一次上层产物；

步骤四：加入1.5mlSR3溶液到所述第一次上层产物当中，涡旋混匀后4℃孵育8-12分钟，以去除蛋白质和细胞碎片后进一步在室温下以2400-2600g 的速度离心9-11min后转移第二次上层产物；

步骤五：加入5mlSR4溶液到所述第二次上层产物当中，混匀后，孵育25-35 分钟后以2400-2600g的速度离心9-11min后收集核酸沉淀；

步骤六：加入1mlSR5溶液到核酸沉淀的收集管中对核酸沉淀物进行重悬得RNA提取物；

步骤七：将所述RNA提取物进行洗脱和若干次重悬后得RNA沉淀。

在本发明的一个优选实施例中，所述细胞裂解液为酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，所述混合溶液的pH范围为6.5-8.0。

在本发明的一个优选实施例中，所述SR4溶液为100％异丙醇。

本发明的有益效果在于：

本发明可以有效解决获得的RNA存在DNA残留的问题，提升RNA前处理的处理精度。

附图说明

图1为现有技术的提取示意图。

图2为本发明的提取示意图。

具体实施方式

本发明的设计思路在于：

土壤样品RNA提取难点之一是存在腐殖质污染。腐殖质会干扰酶促反应， PCR扩增，DNA-DNA的杂交，感受态细胞的转化，核酸的检测和定量，RNA的杂交和RT-PCR等。

因而从土壤RNA中去除腐殖质对分子分析来说十分重要。据报道，DNA与腐殖酸在酸性条件下发生不可逆的结合。因此，当预期将有大量腐殖质进入到提取液时，强烈建议在细胞破碎前就将腐殖质完全去除。PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)呈白色或近白色，具有很强的膨胀性能和与多类物质的络合能力，被广泛报道用于核酸提取过程中腐殖质的去除。