[发明专利]基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法

说明书

本发明涉及一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒、检测方法及其制备方法，通过制备2株针对HIV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠①)，另一株重组抗原用铕离子标记；同时制备另外2株针对HCV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠②)，另一株重组抗原用钐离子标记。先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①‑HIV抗体‑铕标记抗原复合物，及免疫磁珠②‑HCV抗体‑钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附人HIV及HCV抗体的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。本发明检测灵敏度高、时间短、误差小且可靠性高。

技术领域

本发明涉及一种磁性分离技术和时间分辨荧光免疫分析技术的结合，具体是一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法及相应的试剂盒。

背景技术

艾滋病是一种由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染人免疫系统细胞并造成免疫系统缺陷，严重威胁人类健康的疾病。针对该疾病目前尚无免疫预防、无根除体内病毒的有效药物，因此具有高感染率、高病死率的特征。丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。由于HIV与HCV都可以通过输血、静脉吸毒、性传播、母婴垂直传播等途径传播,因而HIV和HCV共感染比较常见。有研究表明，HIV和HCV合并感染率达30％，在吸毒人群中甚至高达70％以上。大部分HIV感染者的肝脏疾病是因为混合感染HCV的结果。丙型肝炎感染引起的慢性肝脏疾病会增加HIV感染者因肝脏损伤，其引起的死亡已成为艾滋病患者死亡的主要原因之一，且共感染可加速HCV感染相关疾病的过程。因此,对HIV、HCV两者合并感染这一世界性的重要公共卫生问题的研究十分重要。

从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，降低血源筛查的残余危险度，在对艾滋病早期诊断的效果上明显优于第3代。但从方法学上来讲，这种基于ELISA的分析方法，灵敏度终归是有限的。相对时间分辨荧光免疫分析技术和化学发光等更先进的分析方法，它的灵敏度比较低。HCV血清学检测试剂在市场化中也存在同样的问题。由此可见，提高敏感性、特异性、缩短窗口期和简便快速是HIV及HCV检测试剂未来发展的主要趋势。时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰，并且可以对同一样品不同分析物进行标记和应用范围十分广泛等优点。然而，目前国内外厂家均采用基于微孔板TRFIA技术研制相应的试剂盒(包括PerKin Elmer公司试剂盒)，由于微孔板的固液相反应面积小，需要的免疫反应时间较久；并且微孔板是通过物理吸附包被抗原或抗体，包被量很难标准化，使得检测结果精密度较差；微孔板TRFIA技术主要为半自动检测，或前处理加上TRFIA检测仪的准全自动检测，使得样本需要积累到一定量后才能检测。

生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。自20世纪70年代，BAS开始应用于免疫化学领域以来，利用BAS可被荧光索、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术，尤其是与免疫标记技术的有机结合，极大地提高了测定的灵敏度。目前，BAS技术已在整个生物学领域中得到广泛应用，成为当今生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。