[发明专利]基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法

权利要求书

1.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。

2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；

其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；

一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。

3.根据权利要求2所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。

4.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：具有如下步骤，

(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；

(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；

(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu³⁺标记，一株HCV-Ag进行Sm³⁺标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu³⁺标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm³⁺标记物的比例为2.5:1；

(4)测定方法：

往反应管加入100μl样品，再加入用分析缓冲液以体积比为1:30稀释的步骤(1)制备的链霉亲和素磁珠50μl，然后加入用分析缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤(2)制备的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟；运用磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤；最后加入用分析缓冲液以体积比为1:25稀释的步骤(3)制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag各100μl，室温震荡孵育45分钟；重复分离洗涤步骤，最后加入200μl增强液震荡孵育5min进行荧光检测。

5.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(1)中，

磁珠活化过程为：取1ml重悬后的磁珠,重复洗涤3次，加入25μl 10mg/ml的EDC和40μl10mg/ml的NHS，用样本旋转混合仪，室温旋转30min；

洗涤过程中使用的洗涤液的为：将25mM的Tris-HCl、0.15M NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到pH 7.2的缓冲液；

封闭过程中使用的封闭液为：以重量份计，含有15％的蔗糖、10％的小牛血清、75％的去离子水，用浓盐酸调节PH值得到的pH 7.0的缓冲液；

磁珠保存过程中使用的保存液为：25mM的Tris-HCl、0.15M的NaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween 20，用浓盐酸调节PH值得到的得到的pH 7.2的缓冲液。

6.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(2)中，

Eu³⁺和Sm³⁺标记抗原稀释所用分析缓冲液的成分为：50mM的Tris-HCl、质量浓度1.5％的PEG 6000、质量浓度0.2％的BSA、体积浓度0.1％的Proclin 300、质量浓度0.02％的牛IgG、体积浓度0.1％的Tween 20、质量浓度0.84％的NaCl，分析缓冲液的pH值为7.8。