[发明专利]蛋白质异质缠结基元的设计与复杂索烃结构的制备方法

说明书

本发明公布了一种蛋白质异质缠结基元的设计与复杂索烃结构的制备方法。本发明对肿瘤抑制因子p53二聚缠结基元(X)进行定点突变，得到异质缠结基元X⁺/X^‑，结合蛋白质偶联反应对，通过组装偶联协同的策略实现了蛋白质异质索烃和高阶索烃([3]索烃/[4]索烃)的细胞内原位合成。该方法具有模块化、可基因编码的特点，能够高效精准合成蛋白质拓扑结构。通过引入目标蛋白质，实现目标蛋白的索烃化构建，且索烃化不会明显影响蛋白质的结构和活性。在高阶索烃骨架中引入抗体或抗体类似物还可以构建“人工抗体”，骨架的多价性显著提高了其对受体蛋白的亲和力，对于蛋白抗体药物的研发具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物大分子蛋白质异质缠结基元的设计，利用设计的基元通过细胞内一步表达的方式高效制备蛋白质异质索烃和高阶索烃结构，以及探索索烃化对目标蛋白质性质的改进，尤其是高阶索烃化对抗体类似物亲和力的提升作用并将其应用于“人工抗体”的设计。

背景技术

传统的蛋白质多数是由线性的多肽链经过进一步折叠形成的，尽管具有丰富的多级结构，但是其拓扑结构却相对单一。近年来的研究发现自然界中通过复杂的翻译后修饰过程可以得到具有环状、打结、索烃等非线性拓扑结构的蛋白质，这些蛋白质体现出了抗热变性、抗化学变性和酶解耐受性等稳定性特征，具有重要的生理意义。但是其中很多天然合成的机理尚不明确，因此探索并发展人工制备的方法具有重要意义。另一方面，以索烃为代表的拓扑结构也是实现蛋白质结构域间机械偶联的手段。不同于传统的化学反应连接和融合表达的偶联方式，这种机械偶联赋予了结构域间相对的动态性，同时环化特有的对蛋白质末端的限域作用减小了其解折叠熵的变化，从而可以提高目的蛋白质的稳定性。

尽管蛋白质索烃被认为是一种相对简单却又体现出重要价值的拓扑蛋白质，但是目前报道的人工设计合成蛋白质索烃的工作仍相对较少。早期的工作中利用肿瘤抑制因子p53缠结二聚基元的组装结合天然化学连接的方式实现了多肽索烃结构的制备(Yan,L.Z.and Dawson,P.E.,Angew.Chem.Int.Ed.2001,113,3737-3739.；Blankenship,J.W.,and Dawson,P.E.,Protein Sci.2007,16,1249-1256)。但该方法只能利用固相合成在体外进行，难以被用于分子量较大的功能蛋白质索烃的制备，这限制了其应用。张文彬课题组则利用可基因编码的p53缠结二聚体以及谍标签/谍捕手(SpyTag/SpyCatcher)反应对通过在大肠杆菌内直接表达，原位实现了蛋白质索烃的生物制备，并完成了多种蛋白质结构域的索烃化，发现索烃化可以提高目标蛋白质的稳定性。进一步他们利用SpyTag/SpyCatcher反应对拆分后重组的活性模板合成法实现了蛋白质异质索烃的合成(Liu,D.,et al,ACS.Cent.Sci.2017,3,473-481；Wang,X.W.and Zhang,W.-B.,Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,3442-3446；Wang,X.W.and Zhang,W.-B.,Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,13985-13989；Da,X.D.and Zhang,W.-B.,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,11097-11104.)。但是以上的工作仍然局限于较为简单的索烃结构的制备，且索烃化的效率也有待提高。

组装和偶联的协同是超分子化学中用于高效构建复杂分子拓扑结构的有效策略，目前也已被应用于蛋白质拓扑结构的设计。合理选取组装和偶联的基元，控制二者相对的动力学过程，在充分预组装的基础上进行定点的关环反应，即可高效得到索烃等拓扑结构。在此基础上，通过定点突变等常用的蛋白质基元设计和改进方法引入更多可控的组装方式，是实现复杂索烃结构构建的有力手段。

发明内容