[发明专利]丝状血凝素检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及丝状血凝素检测试剂盒及其应用。本发明首先获得了一个抗体效价高达10⁷，亲和常数为3.42×10¹¹M^‑1的丝状血凝素(FHA)单克隆抗体，将本发明的单抗包被ELISA试剂盒，可用于酶联免疫法检测百日咳，检测疫苗生产过程以及成品疫苗中丝状血凝素的含量，以便进行疫苗的质控，具有广泛的应用前景与市场价值。

技术领域

本发明涉及免疫学与试剂盒制备技术领域，具体涉及丝状血凝素试剂盒及其应用。

背景技术

百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病,在百日咳疫苗广泛接种之前，它是儿童致死率最高的感染性疾病。通过实施百日咳疫苗的接种,特别是全球实施扩大免疫规划(EPI)后,百白破联合疫苗免疫覆盖率提高，全球的百日咳得到了有效的控制,发病率和死亡率显著下降。据世界卫生组织(WHO)估计,实施疫苗接种后已减少了千万的患病病例及百万的死亡病例。中国自1978年实施扩大免疫规划后，百白破被纳入儿童计划免疫，根据全国疾病监测点百日咳疫情资料分析，发病率从20世纪60-70年代的100/10万-200/10万降至90年代末1/10万，大部分省的报告发病率在0.5/10万左右，流行范围逐步缩小,近十年的全国发病率均0.5/10万。

百日咳杆菌能够产生多种毒性因子，包括百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、黏附素(PRN)、气管细胞毒素(TCT)、腺苷酸环化酶毒素(ACT)等。其中FHA是细胞壁成分，该蛋白质分子具有粘附作用，并且对红细胞有凝集作用。FHA与百日咳杆菌黏附和定居在呼吸道上皮细胞上是至关重要的，是百日咳杆菌致病的重要毒力因子。FHA还具有较强的免疫原性，能刺激机体免疫系统产生特异的保护性抗体，已被世界上很多国家用作无细胞百日咳疫苗的主要组分之一。用FHA免疫的小鼠能抵抗百日咳杆菌的致死性呼吸道攻击，但不能抵抗对脑部的攻击。百日咳杆菌的菌毛是表面结构，可直接通过菌体与型特异性抗血清或单克隆抗体的凝集反应进行检测。

百日咳感染的病原菌诊断是指在患儿卡他期和痉咳初期获得的鼻咽部样本中找到百日咳杆菌，这是百日咳诊断的金标准，但是通常认为直接培养病原菌的灵敏度过低，受到患儿应用抗生素、实验条件、标本采集等因素的影响，而且培养时间较长，不利于疑似患者的快速诊断和治疗，不利于临床早期诊断。

2015版《药典》中提供了对百日咳的鉴别方法，其中有动物法和酶联免疫法。动物法作为传统方法，有其固有的优势，但存在试验周期长、费用高、试验结果波动较大等缺点，并且只能用于进行鉴别，不能用于定量。酶联免疫法试验具有周期短，费用低、结果受外界波动小等优点，不仅可以定性，也可以进行定量。虽然目前有针对PT毒素的ELISA试剂盒，可以便于PT抗原的快速检出及含量检测，但是目前还没有针对FHA毒素的用于百日咳疾病诊断的试剂盒。

此外，在实际生产过程中发现，用于百日咳预防的无细胞吸附百白破疫苗或以百白破为基础制备的联合疫苗，在不同厂家之间、同一厂家不同联合疫苗之间，同一厂家同一产品在不同国家的注册质量标准均存在差异。因此，亟需开发一种能快速准确检测FHA的方法，从而对不同厂家以及同一厂家不同联合疫苗之间的质量标准进行统一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速准确检测FHA的双抗体夹心ELISA试剂盒，以便于FHA抗原的快速检出及含量检测，用于百日咳的疾病诊断，并且为百白破疫苗及以百白破为基础制备的联合疫苗的质量标准的统一奠定基础。

第一方面，本发明提供了针对丝状血凝素的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有三个重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3或保持其功能的保守修饰的变体；以及三个轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3或保持其功能的保守修饰的变体，

所述重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示；以及