[发明专利]一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法在审

申请号：	201911367212.2	申请日：	2019-12-26
公开（公告）号：	CN110964719A	公开（公告）日：	2020-04-07
发明（设计）人：	刘艳艳;孙子奎	申请（专利权）人：	上海派森诺生物科技股份有限公司
主分类号：	C12N15/10	分类号：	C12N15/10
代理公司：	上海天翔知识产权代理有限公司 31224	代理人：	吕伴
地址：	200030 上海市***	国省代码：	上海;31
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摘要：
搜索关键词：	一种改良 trizol 提取胚乳 rna 方法
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【说明书】：

本发明公开了一种改良Trizol法提取淀粉含量高的组织RNA方法，其特征在于，是首先将冷冻后的样品研磨后通过RNA缓冲液和提取溶液进行提取后，逐步离心分离得透明沉淀，后水浴取样检测。本发明与现有的Trizol法或商用提取盒提取效果相比，本发明所提取的胚乳的电泳分离度更好，更便于后续的分析操作。

技术领域

本发明涉及RNA提取领域，具体涉及一种改良Trizol法提取淀粉含量高的RNA方法。

背景技术

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理是在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

而现有的采用Trizol法来提取胚乳RNA提取的方法或其他商用提取方法当中存在以下的不足：因水稻胚乳中淀粉含量很高，且淀粉与核酸性质相似，在提取时会与核酸共沉淀，且在提取过程中导致核酸降解，目前Trizol试剂无法有效分离淀粉与核酸，导致在提取过程中核酸无法提取出来，实验失败。商用试剂盒价格昂贵，且存在与传统Trizol法同样的问题，无法有效去除淀粉，导致提取降解。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种改良Trizol法提取胚乳RNA方法，包括如下步骤：

步骤一：将冷冻后的样品在液氮中研磨后称重，称取不超过0.1g粉末放入390-410ul的RNA缓冲液中放入离心管，剧烈震荡1-2min。

步骤二：在所述离心管中加入240-260ul提取溶液，混匀后在3-5℃的温度下以12000-14000r/min的转速离心13-16min；

步骤三：将步骤二离心后的上清液转移至另一离心管中，加入0.9-1.1mlTRIZzol，室温放置5-7min；

加入190-210ul氯仿后剧烈震荡混匀，室温放置2-3min混匀后在3-5℃的温度下以12000-14000r/min的转速离心13-16min；

步骤四：将步骤四离心后的上清液转移至另一离心管中，加入0.4-0.65ml的异丙醇以及38-42ul的浓度为5M的NaCl溶液，混匀斡旋后室温放置8-12min，在3-5℃的温度下以11000-13000×g的速度离心至离心管底部有白色沉淀；

步骤五：将所述步骤四的离心管中的上清液去除后，加入0.9-1.1ml的75％无水乙醇，室温放置1-2min后在3-5℃的温度下以7000-8000×g的速度离心6-8min后重复所述步骤五至少一次；

步骤六：将所述步骤五的液体中的上清液去除后进行若干离心去除上清液操作后室温干燥至所述白色沉淀变透明；

步骤八：在所述透明沉淀中加入DEPC水后在56-58℃恒温金属浴中充分溶解5-10min后取样检测。