[发明专利]一种人尿液外泌体核酸提取方法

说明书

一种人尿液外泌体核酸提取方法，尿液外泌体的提取：收集晨尿样本，首先离心去除尿沉渣，再将上清液加入离心过滤管，去除大于0.22μm的成分，再将上清加入已处理好的超滤管中，离心浓缩尿液外泌体；PBS缓冲液对浓缩后的尿液外泌体进行洗涤一次，离心再次浓缩尿液外泌体，洗涤膜表面，收集液体即为尿液外泌体；尿液外泌体核酸的提取：上一步骤分离得到的尿液外泌体，直接进行核酸提取，得到高质量的核酸样本。提取过程经过裂解、洗涤、洗脱步骤，可进行手工法操作，也可进行仪器法操作。本发明克服了现有技术的不足，整个提取操作过程操作时间短、无毒性、可实现自动化和高通量，且核酸样本得率较高、纯度较好，易于后续在临床广泛应用。

技术领域

本发明涉及外泌体核酸提取技术领域，具体涉及一种人尿液外泌体核酸提取方法。

背景技术

外泌体，是一类由细胞分泌的30-150nm的小囊泡，除了可一定程度调控生物学过程外，其内部更携带了大量核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白质。近年来随着其在多种疾病领域内研究的深入，发现外泌体可广泛应用于多种疾病的诊断和治疗，对其内容物的检测在液态活检中具有重要的发展前景。应用外泌体对疾病进行诊断，具有较好的准确性，样本来源广泛且取样方便、可达到无创，应用范围广泛，具有极高的潜能和价值。尿液作为临床上常用的检测样本，其易于获得且样本量较大，可更好的实现尤其是泌尿系统疾病的无创诊断，用于疾病早期筛查或复发监测。对尿液外泌体的分离及核酸提取，是后续有效诊断疾病的基础。

对于尿液外泌体分离技术，目前外泌体的提取专利、文献相关报道较多，主要集中于高速离心法、磁珠法、旋转超滤法、超滤法、冻干技术或冻干和磁珠法相结合等。尿液样本具有体积较大、外泌体浓度较低的特点。对于尿液外泌体的提取，大多数已有方法采用的是耗时较长、需特殊离心设备的高速离心法（此方法较为公认，多数尤其是科研用户常用），或需要特殊超滤设备的旋转超滤法、需要配备冻干设备的结合样本冻干技术和磁珠法的外泌体提取方法，另有部分采用的是对于尿液来说提取效率较低、价格较贵的磁珠法。上述尿液外泌体提取方法在使用普遍性或高效性等方面尚存在不足之处，难以在临床广泛应用。超滤法对于大体积样本的提取更具有适用性，但处理后外泌体样本的核酸提取方法多为毒性较大、得率较低的trizol等提取法。

对于外泌体核酸的提取，由于尿液外泌体总量不多，其含有的核酸量较少，因此在后续的核酸提取纯化方面，存在较大的挑战。目前无论外泌体提取方面采用何种方法，对于外泌体核酸对的提取，普遍使用的是毒性较大、需使用有机试剂、得率相对较低、必须人工操作的trizol提取法，本方法更多的是匹配高速离心法进行外泌体提取；近年来部分技术方法使用柱膜法进行核酸提取，在核酸提取得率、纯度方面有一定改善，但提取过程中可能还会使用到具有毒性的试剂成分进行样本裂解，且提取过程必须人工操作，操作时间较长；而此技术方法的外泌体提取部分为柱式提取法，而非超滤法。此外，目前已有的技术方法价格昂贵或操作过程繁琐，不易于实现自动化，难以在临床上实现自动化、高通量。

基于磁珠法的核酸提取技术，对于自动化、高通量的实现方面具有较好的发展前景，逐渐受到临床的认可。但在外泌体提取方面，如何提高核酸样本的得率、纯度等，仍存在一定挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人尿液外泌体核酸提取方法，克服了现有技术的不足，整个提取操作过程操作时间短、无毒性、可实现自动化和高通量，且核酸样本得率较高、纯度较好，易于后续在临床广泛应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种人尿液外泌体核酸提取方法，包括以下步骤：

1）尿液外泌体的提取：

1.1）收集晨尿样本；

1.2） 取所收集的样本于离心管中，涡旋混匀，2000-3000g离心3-8min；