[发明专利]一种人尿液外泌体核酸提取方法

权利要求书

1.一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）尿液外泌体的提取：

1.1）收集晨尿样本；

1.2） 取所收集的样本于离心管中，涡旋混匀，2000-3000g离心3-8min；

1.3）取离心后的上清液加入过滤离心管的内管中，70-100g离心3-10min；使液体全部流入下层外管；其中，过滤离心管包括外管和内管，所述外管安装在内管的下方，所述内管的内壁上固定安装有过滤膜；

1.4）取出过滤离心管的内管，将下层液体转移到已处理好的超滤管内管中，再将超滤管放置于离心机中3000-4000g 离心15-45min；

1.5）倒出超滤管下层外管中的液体，加入1-5mL PBS缓冲液，混匀后，再次3000-4000g离心15-45min，进行超滤浓缩；

1.6）吸取上层内管中的样本至离心管中，即得到尿液外泌体样本；

2）尿液外泌体核酸的提取：

2.1）在离心管中依次加入100-300μL提取所得到的尿液外泌体样本、与样本等体积的裂解液、10-20μL蛋白酶混合液，再加入10μL磁珠悬液和300-350μL异丙醇，进行高速旋涡震荡10-15次，再50℃-70℃孵育15-20分钟，室温放置5分钟；

2.2）将含有磁珠的离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置、至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；且不能将磁珠吸出；

2.3）移去磁力架，向离心管中加入洗涤液以对样本进行充分洗涤，再将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内液体，且不能将磁珠吸出；

2.4）打开离心管盖，于室温干燥2-3分钟，至磁珠表面无明显液体，将待用洗脱液放置于70-90℃预热2-3分钟；

2.5）移去磁力架，加入30-50μL预热好的洗脱液，用枪头吹吸至磁珠分布均匀或高速涡旋10-15次；70℃-90℃孵育5-10分钟，期间每隔1分钟左右摇晃离心管10-15次，使管内磁珠始终保持均匀分布的状态；温育结束后，将离心管高速涡旋10-15次；

2.6）将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到一个无核酶干净的离心管中，即得到纯化后的核酸溶液；

其中，在步骤2.1）中，50℃-70℃孵育15-20分钟以及室温放置5分钟的过程中，期间每隔2分钟上下颠倒离心管10次，使管内磁珠分布均匀；

所述步骤2.3）的洗涤操作具体包括以下步骤：

2.3.1）移去磁力架，加入900μL洗涤液A，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤；再将离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.2）再移去磁力架，再次加入600μL洗涤液A，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤，离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.3）再移去磁力架，加入600μL洗涤液B，用移液器吹散磁珠后将液体带磁珠全部转移入新的离心管内，再将离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内及管盖液体；

2.3.4）再移去磁力架，再次加入600μL洗涤液B，低速旋涡震荡至其分布均匀后，上下颠倒离心管10-15次充分洗涤，瞬时低速离心，将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁后，用移液器吸去管内液体；

其中，所述洗涤液A的组分包括0.1-10M胍盐、10-50%无水乙醇，用于洗涤去除蛋白质等杂质成分；所述洗涤液B的组分包括0.1-10M NaCl、50-90%无水乙醇，用于洗涤去除盐类杂质成分；

所述步骤2.1）中的裂解液的组分包括0.1-10M胍盐、0.1-15%十二烷基硫酸钠、0.1-10MNaCl、1-20mM DTT。

2.根据权利要求1所述的一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于：在步骤1.4）之前对于超滤管的预处理步骤为：在超滤管的内管中加入5-10mL无菌水，2-6℃放置5-10min，并使用之前充分倒出灭菌水后立即使用。