[发明专利]一种提高脐带血利用率的方法

说明书

本发明公开一种提高脐带血利用率的方法，所述包括以下步骤：(1)淋巴细胞分离液(ficoll)分离脐带血；(2)提取单个核细胞：脐带血在淋巴细胞分离液离心后，取体积比例为70～95％的白膜层上层液体分离单个核细胞；(3)制备内皮祖细胞外泌体：取剩下的白膜层液体，通过贴壁培养得到原代内皮祖细胞；分离的单个核细胞可诱导分化为巨核祖细胞，内皮祖细胞扩增培养后可进一步制备内皮祖细胞外泌体；本发明的制备方法可以充分利用同一份脐带血资源，制备过程简单可靠，重复性好，不易受污染，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，对临床治疗有积极意义，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，具体涉及提高脐带血利用率的方法。

背景技术

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在脐静脉中的血液，1970s的研究发现，脐带血中含有丰富的造血干细胞，可以重建人体造血和免疫系统，1989年世界首例脐带血造血干细胞移植成功后，各国科学家经过30年的探索和发展，目前脐带血可以治疗80多种疾病。因此，脐带血造血干细胞已成为重要的生物医学资源，相对于骨髓造血干细胞，脐带血造血干细胞对供者无创，免疫原性低，而且是实体储存，不会产生悔捐等严重影响临床治疗的情况，因此具有巨大的医学价值。但目前同一份脐带血，通常用于单一制备用途，如MKPC或者MNC或者整份进行移植等，利用率低，远不能满足日益多样的临床治疗需求。

由于脐带血造血干细胞可以构建血液细胞的全体系，因此深入挖掘不同细胞的差异，进行分别诱导区别培养等综合利用，从而更充分利用脐带血这一宝贵的生物医学资源，更充分地转化为临床治疗的有效制剂，有直接的医学意义。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足之处而提供一种提高脐带血利用率的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种提高脐带血利用率的方法，包括以下步骤：

(1)脐带血处理：取脐带血，加入淋巴细胞分离液进行离心分离；

(2)提取单个核细胞：取体积为白膜层70～95％的白膜层上层液体，离心分离得到其中的单个核细胞；

(3)制备内皮祖细胞：取剩下的分层液，离心后收集其中的细胞，重悬于内皮祖细胞培养基中，进行原代培养得到内皮祖细胞。

Ficoll是蔗糖的多聚体，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/mL仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜，Ficoll密度梯度离心法，可用来分离人脐带血单个核细胞(MNC)，脐带血MNC含有脐带血造血干细胞(HSC)等丰富的干/祖细胞。红细胞离心后沉于管底；淋巴细胞以及其他单个核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后位于分层液的液面上，形成白膜层，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取白膜层的细胞，就可分离到单个核细胞。操作技术良好的状态下，抽取用于诱导培养的单个核细胞(MNC)的白膜层上层液体，极限值为95％。

在利用Ficoll分离制备单个核细胞时，为了避免提取体积混杂下层分层液体影响后续培养(单个核细胞分为悬浮细胞，下层分层液体的杂质成分会干扰悬浮细胞培养)，抽取白膜层时仅抽取白膜层的上层液体，不会抽取白膜层的全部液体，剩下的少量白膜层通常废弃；这对于宝贵的脐带血来说是一种浪费。本发明将这部分的通常被废弃的白膜层液体用于培养内皮祖细胞，有效增加了脐带血的综合利用的程度，对临床治疗提供了更大的支持。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中取体积为白膜层70～80％的白膜层上层液体分离单个核细胞。

仅取白膜层总体积的70～80％即可有效分离单个核细胞，操作简便快捷，对精细程度要求不高，保证了批量生产过程的高效率。