[发明专利]一株黑曲霉基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株黑曲霉基因工程菌，它是敲除葡聚糖合成调控基因VosA的黑曲霉菌。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法，进一步公开了基因工程菌在生产固定化发酵生产柠檬酸中的应用。本发明通过构建基因敲除聚糖合成调控基因VosA的黑曲霉基因工程菌，使黑曲霉在固定化发酵生产柠檬酸过程中疏水性降低并且生物膜产量降低，减轻了载体的抱团现象，提高了柠檬酸产量和糖转化效率，适宜于工业生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种敲除葡聚糖合成调控基因VosA的黑曲霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

柠檬酸作为全世界需求量最大的有机酸之一，被广泛用于食品、医药、日化等行业。其中，75％的柠檬酸被用于食品工业，主要用于食品添加剂中的酸味剂、抗氧剂、pH调节剂，同时由于柠檬酸具有温和爽快的酸味，普遍用于饮料、糕点、葡萄酒、乳制品等食品的制造。另外有15％是用于化工和纺织业，可以用作缓冲液、络合剂、掩蔽剂、金属助洗剂、媒染剂等等。还有10％的柠檬酸被用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品以及饲料添加剂等等，被广泛应用于医药工业以及畜牧业中。近些年来，由于我国粮食价格普遍上涨，随之而来的就是柠檬酸生产原料成本的大幅上涨。因此如何改进柠檬酸发酵方法并且进一步降低成本就成了我国整个柠檬酸产业最为关心的问题。

黑曲霉发酵产柠檬酸是当前工业发酵生产柠檬酸的主要途径之一，通过细胞固定化的方法可以大幅提升黑曲霉的发酵效率。目前，细胞固定化的方法主要有四种：包埋法、交联法、共价结合法以及吸附法。对于丝状真菌来说，吸附法操作简单，固定过程不需要化学结构的改变，而且理论上适用于所有丝状真菌，更利于在工业上的推广和应用。吸附法的原理主要是依靠载体表面的基团和细胞表面的相互作用力，进而促使细胞吸附在载体表面进行生长。并且当细胞衰亡之后会从载体上脱落，同时有活性的细胞再吸附上去，形成一个动态平衡，使整个微环境形成一个高效的转化系统，整体发酵效率与游离发酵相比有明显的提升。在人们对固定化发酵机理的研究过程中发现，微生物普遍会在载体上形成生物膜，并且所形成的生物膜不同会导致固定化发酵的性能发生很大的差异。

发明内容

发明目的：为解决现有工业上黑曲霉发酵生产柠檬酸时产量低、发酵周期长的问题，本发明提供了一株葡聚糖合成调控基因VosA缺陷型的黑曲霉基因工程菌，并提供了该黑曲霉基因工程菌的构建方法及其在发酵制备柠檬酸中的应用。

技术方案：本发明第一方面提供一株黑曲霉基因工程菌，该菌株中葡聚糖合成调控基因VosA失活。

该黑曲霉基因工程菌通过双交换方法，利用hyg抗性基因(潮霉素抗性基因)替换掉基因VosA部分序列的基因工程菌，基因VosA可以识别Fks(葡聚糖合酶)家族基因启动子中的VRE区域(CTTATCCGGCC)并与之结合，从而调控Fks家族基因的表达。该基因对Fks家族基因是负调控，与启动子结合后会抑制Fks的转录，从而抑制β-1,3葡聚糖的合成，继而影响了细胞壁厚度以及胞外完整性，导致疏水层的缺失，降低黑曲霉的疏水性，大大减弱了吸附性能和生物膜的形成，从而影响固定化发酵效果和柠檬酸的产量。

优选地，原始黑曲霉为Aspergillus Niger ATCC12846。

优选地，所述葡聚糖合成调控基因VosA失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，未失活的葡聚糖合成调控基因VosA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第二方面提供该黑曲霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取原始黑曲霉的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，扩增得到基因VosA的上游同源臂和下游同源臂；以质粒PAN7-1为模板，扩增得到潮霉素抗性基因；以基因VosA的上游同源臂、下游同源臂和潮霉素抗性基因为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到基因敲除片段；