[发明专利]一种检测啤酒中呕吐毒素的方法

说明书

本发明公开一种检测啤酒中呕吐毒素的方法，包括以下步骤：S1、样品模版DNA制备；S2、引物合成；S3、qPCR反应体系；S4、qPCR定量。本发明通过对NCBI数据库中镰刀菌产生DON的特异序列设计引物，并通过qPCR技术检测呕吐毒素的含量，可初步用于预警，避免国产啤酒的一个食品安全隐患。

技术领域

本发明涉及检测方法技术领域，具体是一种检测啤酒中呕吐毒素的方法。

背景技术

呕吐毒素，学名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,简称DON)，由易于侵染田间生长的大麦、小麦、玉米等谷物的多种镰刀菌(Fusarium spp.)产生。DON具有耐热和水溶两大特性，在食品加工过程中不易被破坏，被联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一，并提出每人每日最大摄入量1μg/Kg体重。我国《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》规定，食品加工用小麦、大麦、玉米中DON的限量标准为1mg/kg。

研究表明，DON从大麦原料经酿造过程进入成品啤酒的途径有两种：一，啤酒大麦在田间生长阶段原始积累的DON，在啤酒生产过程中不能被破坏或通过麦糟除去的部分经过发酵液带到成品啤酒中；二，存留在啤酒原料籽粒内部的产毒镰刀菌，在啤酒生产过程中，主要是麦芽制造阶段，再次产生的DON也会一起进入成品啤酒中。而后者是主要途径，因为啤酒大麦发芽之前的浸泡过程中，籽粒中原始积累的DON大部分(约90％)会流失到浸麦水中，而接下来的发芽阶段，在15-18℃的温度和90％以上湿度的适宜环境下，大麦籽粒中的镰刀菌再次大量合成DON，是成品啤酒中DON的主要来源。从江苏省采收的赤霉病啤酒大麦研究发现，在大麦发芽阶段产生的DON，其总量约占原料大麦中的50％，而麦芽中约90％的DON最终可以进入成品啤酒中。因此，啤酒中DON主要来源于麦芽制造阶段镰刀菌的产毒。

啤酒是以发芽的啤酒大麦为主要原料，添加其它谷物(小麦、大米、玉米淀粉等)，经麦芽制造、麦汁提取、加酒花煮沸、酵母发酵酿造而成的一种含有二氧化碳、低酒精度的饮料。而我国啤酒生产的一个重要特点是以小麦作为原料的比例较高。传统上，啤酒酿造的主要原料是啤酒大麦，而我国所种植啤酒大麦的产量远远不能满足我国啤酒高产量的需求，近70％的啤酒大麦依赖于进口，大幅提升了国产啤酒的原料成本。而我国是小麦生产大国，小麦价格远远低于啤酒大麦价格。同时，在国内啤酒行业恶性价格战引起的啤酒利润空间较低的形势下，小麦作为啤酒酿造替代原料的比例不断升高，国产啤酒酿造原料中小麦的比例通常高达50-60％，甚至100％采用小麦原料。目前，小麦啤酒市场前景广阔。小麦作为啤酒生产原料，其加工过程包括浸麦、发芽和焙燥三个阶段。在浸麦，即按照一定工艺条件的麦子浸泡过程中，麦子籽粒表面的微生物被清洗，麦子并吸收水分为发芽做准备。麦子发芽主要目的在于生成大量的酶使得淀粉、蛋白质等大分子物质降解为后续啤酒发酵过程中易于酵母代谢的小分子物质，发芽的一般条件为温度在16-18℃之间，环境湿度达到90％以上，发芽4天左右。焙燥阶段将麦子烘干，使发芽进程结束。在发芽过程中，麦子籽粒内部没有被清洗掉微生物，尤其是小麦在田间生长的灌浆期易于污染的镰刀菌不能不充分清洗掉，会在这种适宜的条件下再次大幅生长，并大量产生DON。

近些年，世界上发达国家对啤酒中DON检出事件的报道逐渐减少，主要原因在于，目前采取了控制啤酒酿造原料中DON含量的策略。加拿大对啤酒大麦中DON的限量为“未检出”，美国对FDA一般食品加工用的小麦、大麦等谷物中DON的限量为1mg/kg。然而，美国啤酒行业规定对DON含量的限量标准为0.5mg/kg，拒绝收购DON含量超过0.5mg/kg的啤酒大麦，对于DON含量在零与0.5mg/kg之间的啤酒大麦采取打折收购的政策，确保啤酒中DON基本为“零检出”。然而，与之形成鲜明对比的是，我国作为世界啤酒生产第一大国，目前中既没有对啤酒中DON发生情况的任何报道，也未出台对啤酒酿造中原料中DON含量相关的国家或行业标准。这是国产啤酒的一个食品安全隐患，同时也是阻碍国产啤酒出口的较大障碍，因此需要对啤酒中的呕吐毒素进行检测以防范于未然。

发明内容