[发明专利]重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法

权利要求书

1.一种重组表达大熊猫促黄体生成素的载体，其特征在于，其包括编码大熊猫LHβ亚基的第一基因和编码大熊猫LHα亚基的第二基因，所述第一基因的序列为SEQ ID NO.1所示，所述第二基因的序列为SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体，其特征在于，所述载体还包括连接序列；

优选的，所述连接序列为T2A序列，所述T2A的序列为SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1或2所述的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体的宿主细胞表达系统。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞表达系统，其特征在于，所述宿主细胞表达系统是将所述载体转入宿主细胞中构建而成；

优选的，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。

5.一种生产重组大熊猫促黄体生成素的方法，其特征在于，其包括如下步骤：培养权利要求3或4所述的宿主细胞表达系统。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养宿主细胞表达系统前还包括载体构建步骤和细胞表达系统的构建，其包括如下步骤：

A：合成第一基因、T2A序列和第二基因；

B：将插入片段第一基因、T2A序列和第二基因一起连接到慢病毒表达载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，构建含有所述第一基因、T2A序列和第二基因的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体；

C：将所述重组表达大熊猫促黄体生成素的载体-CMV-MCS-EF1-Puro及慢病毒包装质粒共转入HEK293T细胞中，收集纯化重组慢病毒并感染CHO-K1细胞，构建含有表达重组大熊猫促黄体生成素的载体的CHO-K1细胞稳定表达系统。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤B中质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro先进行EcoR I和BamH I酶双酶切以线性化载体，再进行EcoR I和BamH I酶双酶切以线性化插入片段，通过T4 DNAligase酶将线性化的插入片段连接到线性化的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro上。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤C中，所述重组表达大熊猫促黄体生成素的载体通过慢病毒表达体系制备重组慢病毒感染CHO-K1细胞以获得稳定表达细胞系统；

优选的，所述慢病毒表达体系为pCDH+psPAX2+pMD2.G。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养宿主细胞表达系统是在含有嘌呤霉素的培养体系下进行CHO-K1细胞培养；

优选的，所述嘌呤霉素的浓度为5-10μg/ml之间；

优选的，所述CHO-K1细胞培养方式包括如下步骤：CHO-K1细胞每3天传代一次，置于二氧化碳培养箱中培养；

优选的，置于37℃，5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将重组表达的大熊猫促黄体生成素进行分离纯化；

优选的，所述分离纯化的方法包括将细胞培养液离心，超滤浓缩，得到超滤品。