[发明专利]一种新型邻苯二甲酸酯水解酶EstJ6及其编码基因与应用

说明书

本发明提供了一种来源于土壤宏基因组文库的新型邻苯二甲酸酯水解酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2所示。将该酯酶基因连接到表达载体pET28a(+)后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源表达。纯化后的重组酶(EstJ6)分子量为33.31kDa。EstJ6对邻苯二甲酸酯具有广泛的底物特异性，EstJ6不仅可以水解具有简单侧链的邻苯二甲酸酯，而且可以水解具有复杂且较长侧链的邻苯二甲酸二乙基己酯和邻苯二甲酸单乙基己酯。此外，定点突变实验表明EstJ6的催化三联体残基为S146‑E240‑H270，三者中任何氨基酸的突变都会导致EstJ6失去催化能力。本发明中的新型邻苯二甲酸酯水解酶，由于其特有的活性及酶学特性，使其可应用于食品工业、农业及生物技术等领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从土壤宏基因组文库中筛选获得一种新的邻苯二甲酸酯水解酶，其编码基因及其应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类有毒有机化合物，因其在塑料制造中被广泛用作添加剂或增塑剂而在环境中无处不在。其中六种(邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，邻苯二甲酸二辛酯(DNOP)，邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP))已经被美国环境保护局及其一些国际同行列为优先污染物。其中，DEHP在环境中占有很高的比例(约31％)。由于PAEs的大量使用导致严重的环境问题和多种疾病，包括呼吸系统疾病，儿童肥胖和神经心理障碍等。

随着人们对PAEs潜在危害的全面认识，消除PAEs已引起广泛的关注。PAEs的微生物降解是目前最常用的方法，虽然已经分离和鉴定了许多降解PAEs的微生物，例如Enterobacter sp.，Agrobacterium sp.及Pleurotus ostreatus。然而，在这些微生物中具有DEHP降解活性的酶仍然未知。因此，寻找有效的新型邻苯二甲酸酯降解酶是非常关键的，特别是对DEHP的降解。

研究表明，通过传统的培养技术发现新型酯酶的效率非常低，因为在现有实验条件下仅有极少数的微生物可被培养，超过99％的微生物都是不可培养的，极大限制了新型酶的开发与利用。宏基因组学作为一种不依赖于培养的技术，可以避免天然的缺陷，被认为是用于获取和研究微生物资源的最好方法之一。通过直接提取环境中可培养和不可培养微生物的所有DNA，构建宏基因组文库用于筛选新型酶，大大扩展了微生物资源的利用空间，是研究和开发不可培养微生物的有效方法。基于功能筛选的宏基因组策略已经成功应用于新型酶的发现，如阿魏酸酯酶、木聚糖酶和蛋白酶等，这些酶具有增强的酶学特性。

本研究通过功能筛选从土壤宏基因组文库中分离出一种新的邻苯二甲酸酯水解酶基因estj6，对该基因进行异源表达，并对重组酶EstJ6进行纯化、酶学表征、同源建模及定点诱变。EstJ6将成为生物质降解和环境保护的有趣候选者，这说明了宏基因组策略在农业、食品工业和生物技术应用中开发新型酶基因的优势。

发明内容

本发明从土壤宏基因组文库中筛选到一种新型邻苯二甲酸酯水解酶基因，并对该基因进行了异源表达，纯化后的重组酶(EstJ6)分子量大小为33.31kDa。系统发育分析表明EstJ6是第IV家族的新成员。生化表征表明，EstJ6在40℃和pH7.5下对DBP表现出最高的活性(128U/mg)。EstJ6对(C1-C9)邻苯二甲酸酯类化合物具有广泛的底物特异性，EstJ6不仅可以水解具有简单侧链的邻苯二甲酸酯，而且可以降解具有复杂且较长侧链的邻苯二甲酸二乙基己酯和邻苯二甲酸单乙基己酯。定点突变实验表明，EstJ6推定的催化三联体残基为S146-E240-H270。

本发明的第一个目的在于提供一种新型邻苯二甲酸酯水解酶。

本发明的第二个目的在于提供编码上述新型邻苯二甲酸酯水解酶基因。

本发明的第三个目的在于提供上述基因的宏基因组学筛选方法。