[发明专利]靶向人膜结合型和可溶性NKG2D配体的嵌合受体、核酸分子、免疫效应细胞及其应用

说明书

本发明公开了一种靶向人膜结合型和可溶性NKG2D配体的嵌合受体、核酸分子、免疫效应细胞及其应用，属于生物医学或生物工程技术领域。本发明中靶向人膜结合型和可溶性NKG2D配体的嵌合受体使用人天然NKG2D分子的配体结合结构域靶向多种NKG2D配体，通过“配体/受体”特异性识别肿瘤相关表面抗原NKG2DLs，并经由胞内的信号传导分子将活化信号传递到免疫细胞内，从而激活免疫细胞的杀伤活性，最终清除肿瘤细胞。基于NKG2D‑NKG2DLs蛋白质复合体结构以及受体二聚化活化机制，本发明使用单体型铰链区使得该嵌合受体可以同时响应于肿瘤细胞表面的NKG2DLs和脱落到肿瘤微环境中的可溶性NKG2DLs，从而将可溶性NKG2DLs的免疫抑制作用重新转变为免疫激活作用。

技术领域

本发明涉及一种靶向人膜结合型和可溶性NKG2D配体的嵌合受体、核酸分子、免疫效应细胞及其应用，属于生物医学或生物工程技术领域。

背景技术

近年来，以嵌合抗原受体改造T细胞(CAR-T)为代表的肿瘤免疫细胞治疗技术因其对恶性肿瘤的卓越疗效而备受关注。目前以CD19为靶点的CAR-T疗法在血液恶性肿瘤中取得了显著效果，为人类攻克恶性肿瘤打开了新的希望之门(Nature Reviews ClinicalOncology,2018,15:31–46)。然而，现有CAR-T技术存在着若干缺陷，如易诱发细胞因子风暴(CRS)、对实体瘤疗效不佳等(International Reviews of Immunology,2015,34(2):154-187)。而治疗实体瘤才是抗肿瘤的真正主战场。

研究发现，自然杀伤(NK)细胞具有替代T细胞成为免疫疗法理想载体的潜力(Molecular Therapy,2017,25(8):1769-1781)。NK细胞是重要的免疫细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线。与T细胞相比，NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势。作为最常用的人NK细胞系，NK92细胞的临床研究证明其对多种实体肿瘤细胞具有毒性，并且对人体安全无毒副作用，可实现异体治疗，但其疗效十分有限(Immunotherapy,2016,65(4):485-492)。这提示我们将CAR-T的设计原理应用到NK细胞上，利用具有更高的安全性和可控性的NK92细胞(Immunotherapy,2017,9(9):753-765)，有望实现更经济的现货供应(Off-the-Shelf)式的实体肿瘤治疗。

NK细胞的主要活化受体NKG2D在肿瘤免疫监视中起着关键作用。NKG2D表达于NK细胞和NKT细胞等(International Journal of Molecular Sciences,2018,19(1):177)，其单独活化足以刺激NK细胞的活化，引发脱粒和细胞因子产生。NKG2D是极具潜力的CAR-NK构建元件。NKG2D受体是C型凝集素样受体，属于NKG2家族，由位于12p12.3-p13.1的NK基因复合体(NKC)编码，具有使NK细胞识别和清除感染或肿瘤细胞的能力。人体内NKG2D的配体(NKG2DLs)主要为MICA/B及人巨细胞病毒蛋白UL16的结合蛋白(ULBPs)两大类，共计8种。正常细胞表面极少表达NKG2DLs，其表达主要发生在细胞感染或恶性转化的过程中，尤其是肿瘤细胞表面通常至少表达一种NKG2DL，因此被称为是细胞应激状态的指示器。

然而，恶性细胞(如肿瘤细胞)发展了多种途径来阻止或降低NKG2DLs的表达，进而躲避免疫监视。研究发现，NKG2DLs阳性肿瘤细胞免疫逃逸的主要机制是肿瘤细胞往往将其膜表面的NKG2DLs(即膜结合型mNKG2DLs)通过金属蛋白酶水解方式脱落下来，以可溶性NKG2DLs(sNKG2DLs)的形式存在于肿瘤微环境中。可溶性NKG2DLs与NKG2D结合后促进受体内化，从而降低NK细胞或CD8⁺T细胞对其杀伤作用(Frontiers in Immunology.2018；9:2040)。此外，结合sNKG2DLs后引起NKG2D的持续性活化也会严重损伤NKG2D介导的NK细胞的毒性作用。因此，增强NKG2D与NKG2DLs的识别作用，并阻断sNKG2DL引起的免疫抑制效应可成为实体瘤免疫治疗的新途径。