[发明专利]香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法

说明书

本发明公开一种香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法及其重组蛋白的应用。本发明香港巨牡蛎BPI基因序列如ESQ ID NO：1所示，其克隆方法为根据与BPI基因同源的保守序列设计特异引物扩增基因；香港巨牡蛎BPI蛋白序列如SEQIDNO.2所示；用分别含有NdeI位点和XbaI位点的引物扩增香港巨牡蛎BPI成熟蛋白；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是对溶藻弧菌和副溶血弧菌具有明显的杀菌作用。

【技术领域】

本发明涉及生物分子标记技术领域，具体涉及香港巨牡蛎Ch-BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和香港巨牡蛎Ch-BPI基因工程菌构建方法。

【背景技术】

杀菌通透性增强蛋白(Bactericidal permeability-increasing protein，BPI)是脂质转移/脂多糖结合蛋白大家族的成员，在先天免疫系统中起着至关重要的作用。BPI最初分别从兔粒细胞和血清中分离出来，随后在人、牛和兔等多种动物中进行了克隆并鉴定。BPI具有抗菌杀菌、中和内毒素、免疫调理等多种作用。BPI的重要好处在于其是中性粒细胞的嗜天青颗粒成分,为动物本身抗菌成份，不存在耐药性问题，同时对机体不产生任何损害。BPI与抗菌素合用，效应增强，在体液中不影响其生物活性的发挥，因此BPI存在着广阔的应用前景。

对BPI生物学功能研究主要集中在人和其它哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中研究相对较少。而无脊椎动物缺乏适应性免疫，以天然免疫为主，同时为开放式体循环，直接跟病原菌接触，研究BPI对理解其免疫机制，防治疾病具有重要意义。目前BPI蛋白活性仅在太平洋牡蛎、三角帆蚌、魁蚶等少数贝类中开展初步研究。然而，香港巨牡蛎BPI蛋白的分子特征及功能尚不清楚。

香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)，又称近江牡蛎、大蚝、白肉蚝、生蚝,属巨牡蛎属(Crassostrea)，是暖水性双壳类软体动物，以滤食海水浮游生物为主,其肉质鲜美，营养丰富，被誉为“海底牛奶”,是我国华南沿岸的重要养殖资源和最主要的养殖种类之一。但随着养殖历史的延长和大规模、高密度养殖的发展，以及养殖环境的日益恶化，养殖病害已成为海洋贝类养殖产业发展的重要制约因素。其中细菌性疾病是目前发病率最高、造成损失最大的疾病之一。盲目和滥用抗生素，不但不能有效控制疾病，还会破坏水环境，同时危害生态安全。而长期用药会导致病原菌对药物产生耐药性，并带来环境污染和药物在贝类体内残留等一系列问题。因此，构建抗菌肽基因表达工程菌，进而产业化生产高效而廉价的天然抗菌药物迫在眉睫。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是提供一种香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及其克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法，表达的重组蛋白对溶藻弧菌、副溶血弧菌具有明显的杀菌作用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种香港巨牡蛎BPI基因，该基因具有ESQ ID NO：1所示的cDNA序列。

一种香港巨牡蛎BPI基因的克隆方法，具体步骤是：根据BPI基因同源序列保守区域设计引物，引物名称和序列为：ChBPI-F1：TGTTGTGTGAAAAGCCACA；ChBPI-R1：TATATCCGTCTTCTGTGAAAAA。PCR反应体系为：总体积25ul，包括10×PCR缓冲液2.5ul、dNTP(2.5mmol/L)2.0ul、两种引物(25mmol/L)各1ul、水17.3ul、Taq聚合酶(中国大连Takara)0.2ul和cDNA模板1ul。PCR反应条件：94℃5min，35个循环；94℃30s，55℃45s，72℃1min，然后72℃10min，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体(中国大连TaKaRa)中，转化到大肠杆菌中，在含氨苄的LB培养基平板上涂板，挑阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，测序所得基因序列如ESQ ID NO：1。