[发明专利]香港巨牡蛎BPI基因、编码蛋白及克隆方法和重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌构建方法

权利要求书

1.一种香港巨牡蛎BPI基因，其特征在于，该基因具有ESQID NO：1所示的cDNA序列。

2.一种香港巨牡蛎BPI基因的克隆方法，其特征在于，具体步骤是：根据BPI基因同源序列设计引物，引物名称和序列为：ChBPI-F1：TGTTGTGTGAAAAGCCACA；ChBPI-R1：TATATCCGTCTTCTGTGAAAAA；PCR反应体系为：总体积25ul，包括10×PCR缓冲液2.5ul、dNTP(2.5mmol/L)2.0ul、两种引物(25mmol/L)各1ul、水17.3ul、Taq聚合酶(中国大连Takara)0.2ul和cDNA模板1ul；PCR反应条件：94℃5min，35个循环；94℃30s，55℃45s，72℃1min，然后72℃10min，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中，转化到大肠杆菌中，在含氨苄的LB培养基平板上涂板，挑阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，测序所得基因序列如ESQID NO：1。

3.一种如权利要求1所述的香港巨牡蛎BPI基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白具有ESQID NO：2所示的氨基酸序列。

4.一种利用权利要求3所述的香港巨牡蛎BPI基因的编码蛋白编码基因构建重组香港巨牡蛎BPI基因工程菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)pCznI-bpi测序验证

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，

Ch-BPI-F2：ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGAAGACCCCGGGCCTGCAGACCCGC；

Ch-BPI-R2：GATTCTGTGCTTTTAAGCAGAGATTACCTATCTAGATTAGCCACTATATTTCAGATCGGT；

酶切位点NdeI和XbaI，将获得的重组质粒pCznI-bpi转入TOP10克隆菌株；

(2)pCznI-bpi载体转化至大肠杆菌Rosseta

将重组质粒1μL加入100μL感受态细菌中，置冰上20min。42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μL LB培养液；37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mL Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜；

(3)IPTG诱导pCznI-bpi载体融合蛋白的表达

挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Amp的3mL LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；次日按1：100接种于50μg/mL Amp的30mL LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，进行12％SDS-PAGE检测分析，目标蛋白取沉淀；

(4)包涵体蛋白的变复性

1)将菌体沉淀重悬于20mL裂解液，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；

2)将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；

3)使用包涵体洗涤液洗涤包涵体3次；

4)用溶解缓冲液，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min；

5)将30mL上述溶液逐步滴加到30mL 20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，缓慢搅拌，滴加速度在1mL/1min，再将稀释蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15MNaCl，pH8.0溶液中透析过夜；

(5)融合蛋白Ni柱纯化

a)利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱；

b)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

c)用Ni-IDA Washing-Buffer以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

d)用Ni-IDA ELution-Buffer以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

e)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜，12％SDS-PAGE检测分析。