[发明专利]一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法

权利要求书

1.一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：AGEs的提取：

1.1将样品溶于硼酸盐缓冲液和硼氢化钠溶液，防止后续处理过程导致样品发生还原反应产生AGEs；

1.2将样品进行酸解，使与蛋白结合的AGEs解离，转变成游离态AGEs；

1.3向样品中加入内标品以校正误差；

1.4将样品过固相萃取柱，纯化AGEs，其中采用甲醇活化MCX固相萃取柱，用含5%氨水的甲醇溶液洗脱；

1.5将样品过滤膜以除掉杂质；

步骤2：制作标准曲线：以标准品的浓度值为横坐标，以标准品面积*（内标品浓度/内标品面积）作为纵坐标绘制标准曲线，得到方程；

步骤3：将处理后的样品进行HPLC-MS/MS检测，检测模式为MRM，得到样品中AGEs峰面积，求得样品中AGEs浓度；

液相色谱条件为：

色谱柱：BEH Amide 100mm×2.1mm 1.7μm；

流动相A：含有0.25mol/L乙酸铵和1%甲酸的水溶液；

流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：

；

AGEs组分包括羧甲基赖氨酸CML、羧乙基赖氨酸CEL、甲基乙二醛氢咪唑酮MG-H1三种。

2.根据权利要求1所述的一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：所述步骤1.1为每克冻干样品中加入20-25mL 0.2 mol/L pH9.2的硼酸盐缓冲液和4-5mL 2mol/L用0.1mol/L氢氧化钠溶液配制的硼氢化钠溶液，4℃条件下反应8-10h。

3.根据权利要求1所述的一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：所述步骤1.2中酸解条件为每克冻干样品中加入40-45mL 6mol/L HCl，110℃酸解24-26h，氮吹浓缩至近干。

4.根据权利要求1所述的一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：所述步骤1.3中的内标品为CML-d₄、CEL-d₄、MG-H1-d₃。

5.根据权利要求1所述的一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：所述步骤1.4为用3-6mL甲醇活化MCX固相萃取柱，用3-6mL含2%甲酸的水溶液平衡MCX固相萃取柱，将样品溶液过MCX固相萃取柱，用3-6mL含2%甲酸的水溶液和3-6mL甲醇依次除杂，真空抽干后用2-3mL含5%氨水的甲醇溶液洗脱，真空抽干后收集洗脱液，并用氮吹浓缩至近干。

6.根据权利要求1所述的一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，所述步骤3中液相色谱条件还包括流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样体积：3μL。

7.据权利要求1所述的检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，所述步骤3中质谱条件为：

离子源：电离子喷雾；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：MRM；

干燥器温度：350℃；

干燥气流量：10L/min;

雾化器压力：20psi;

毛细管电压：4000V；

碎裂电压：135V。

8.根据权利要求1所述的检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于：样品为鱼类制品，其CML的标准曲线为Y＝9.88214X，CEL的标准曲线为Y＝17.4349X，MG-H1的标准曲线为Y＝9.38507X，其中标准品浓度的范围为0.01～0.20μg/mL，X为标准品的浓度值，Y为标准品面积*（内标品浓度/内标品面积）。