[发明专利]检测非洲猪瘟病毒感染性的PCR引物和探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种快速检测非洲猪瘟病毒感染性的PCR引物和探针、试剂盒及检测方法，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的试剂盒包含上述PCR引物和探针及与核酸结合并具有光敏特性的核酸染料，通过光敏核酸染料预处理待检样本，并以未进行光敏染料预处理的样本为对照样本，然后提取待检样本及对照样本核酸，qPCR法分别检测待检样本及对照样本的非洲猪瘟病毒保守基因拷贝数，通过比较二者的基因拷贝数快速判断待检样本中是否存在感染性非洲猪瘟病毒。该试剂盒检测耗时短、特异性强、结果可靠、结果判断简单，适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等，对非洲猪瘟病毒的消杀、防控等措施的判断具有重要意义。

技术领域

本发明涉及非洲猪瘟病毒检测领域，更具体地，涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒感染性的PCR引物和探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)是一种双链DNA病毒，感染家猪和野猪并导致猪发生急性出血性的烈性传染病病毒，由该病毒引起的疾病统称为非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)。2018年8月3日ASFV首次在我国辽宁省沈阳市沈北新区爆发，数月后在全国广泛传播。ASFV具有急性感染、高致死率等特点，因此已对中国乃至世界的农业经济造成重大损失。自1921年肯尼亚就出现了ASFV，但目前未研发出有效的疫苗或药物进行治疗。预防、控制病毒传播，扑杀病猪仍然是最有效的方式。因此，建立快速的非洲猪瘟病毒检测方法对于早发现病毒、早控制病毒传染源具有非常重要的意义。

由于非洲猪瘟病毒野毒株仅能在猪原代细胞中进行增殖，且分离培养时间较长。因此，目前非洲猪瘟病毒的检测主要是基于核酸的PCR检测技术。一般过程为在待测样本中加入裂解试剂后提取核酸，通过PCR扩增或等温扩增等技术检测ASFV病毒的特征序列(大多检测B646L(或称p72)基因)，具有无需分离、快速、灵敏等优点，是目前使用最广的方法。但该方法只能检测样本中是否存在病毒的核酸特征序列，对于样本中的病毒是否完整和感染性等均不能给出有效信息。对于非洲猪瘟疫情的确定以及使用消毒剂消杀后样本中的病毒是否仍具有感染性，还需要用经典的病毒培养分离方法确定。非洲猪瘟病毒的分离培养不仅如上提到的要使用原代细胞、耗时耗力，而且按照农业部对于高致病性动物病原微生物实验活动的管理要求，需在具有生物安全防护条件下的P3级实验室内进行，这使得通过分离培养来进行非洲猪瘟病毒的感染性检测对于猪场或一般兽医实验室不具有可行性，给非洲猪瘟病毒的实际防控，如确定感染途径、消毒灭活是否彻底、已发生ASF疫情的猪场经过处理后环境是否还有活毒等，带来了极大的不便，急需发展一种快速简便的替代技术。

DNA修饰染料-叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)是一种与双链DNA高亲和结合的光敏染料，在强烈的可见光下与结合的DNA形成稳定的共价交联，阻碍PCR的扩增。同时，该染料具有不透过完整细胞膜的特性，因此能用来选择性地修饰死细胞因膜不完整而暴露的DNA，而拥有完整细胞膜的活细胞中DNA则不能被修饰。在PCR反应之前通过加入PMA进行预处理菌样品可选择性地检测活菌数量。该方法(PMA-qPCR)已在区分检测食物和环境样本中死活细菌以及部分病毒(诺如病毒、甲肝病毒、噬菌体等)的感染性中得到很好地应用，但在检测ASFV感染性等方面尚未见报道。

发明内容

鉴于现有的细胞培养分离技术耗时长，且ASFV仅在猪原代细胞中增殖，病毒的分离培养活动必须在具有生物安全防护条件下的P3级实验室内进行等限制因素，本发明提出了一种快速检测非洲猪瘟病毒感染性的PCR引物和探针、试剂盒及检测方法，本发明对于非洲猪瘟病毒的实际防控，如确定感染途径、消毒是否彻底、已发生非洲猪瘟疫情的猪场经过处理后环境是否还有活毒和消除潜在的病毒传播途径等，有着重要意义。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：