[发明专利]检测非洲猪瘟病毒感染性的PCR引物和探针、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.快速检测非洲猪瘟病毒感染性的PCR引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的PCR引物和探针在检测非洲猪瘟病毒及制备非洲猪瘟病毒检测标准化试剂盒中的应用。

3.一种快速检测非洲猪瘟病毒感染性的试剂盒，其特征在于，包括：1)权利要求1所述的PCR引物和探针，2)与核酸结合并具有光敏特性的核酸染料。

4.根据权利要求3所述的一种快速检测非洲猪瘟病毒感染性的试剂盒，其特征在于，所述与核酸结合并具有光敏特性的核酸染料为叠氮溴化丙锭。

5.根据权利要求3所述的一种快速检测非洲猪瘟病毒感染性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq DNApolymerase、Buffer、dNTP和灭菌水。

6.基于权利要求3-5任一项所述试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒感染性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待检样本等体积分成2份，其中1份进行光敏核酸染料预处理，另一份添加灭菌水或缓冲液作为对比样本；

(2)分别提取两份待测样本的总DNA；

(3)分别以步骤(2)中提取的两份DNA为模板进行qPCR实时荧光定量检测；所述qPCR反应中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

(4)qPCR反应结束后，根据两份核酸样本荧光定量PCR反应的扩增曲线和循环阈值，快速检测样本中是否存在感染性非洲猪瘟病毒。

7.根据权利要求6所述的快速检测非洲猪瘟病毒感染性的方法，其特征在于，所述光敏核酸染料预处理待检样本的具体步骤包括以下：

1)待检样本于无DNase和RNase酶的EP管中离心，收集上清；

2)取180μl上清液置于无DNase和RNase酶的EP管中，避光向其中加入20μl PMA，混匀后，室温避光孵育5～15min；所述PMA初始浓度为100～1000μM；

3)立即将EP管转至冰上，然后使用PMA-Lite^TMLED光解仪对样品光解15～30min，期间不断摇晃使PMA与暴露的核酸充分共价交联。

8.根据权利要求6所述的快速检测非洲猪瘟病毒感染性的方法，其特征在于，所述qPCR反应体系为：Taq DNApolymerase 0.5μl，10×buffer 2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，20μM SEQID NO.1所示引物0.4μl，20μM SEQ ID NO.2所示引物0.4μl，20μM SEQ ID NO.3所示探针0.8μl，模板2μl，灭菌水12.3μl；所述10×buffer包含：200mM Tris-HCl(pH 8.3)，200mMKCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄及5wt％NP40。

9.根据权利要求6所述的快速检测非洲猪瘟病毒感染性的方法，其特征在于，所述qPCR反应条件为：95℃预变性2min，之后循环40次；每个循环的程序为：95℃变性5sec，57℃退火30sec，收集FAM荧光通道的信号，循环结束后，结束反应。

10.根据权利要求6所述的快速检测非洲猪瘟病毒感染性的方法，其特征在于，检测样本中是否存在感染性非洲猪瘟病毒的标准为：(1)光敏核酸染料处理后的样本Ct值相比未加染料预处理的样本Ct有变大，表示样本中含有失活的ASFV；(2)ΔCt越大，表示失活的病毒含量越高；(3)ΔCt≥6或光敏核酸染料处理后的样本组qPCR反应无典型扩增曲线且Ct＞38，则指示样本中病毒全部失活。