[发明专利]一种尿激酶的制备方法及其冻干粉

说明书

本发明涉及一种高纯度大分子尿激酶的制备方法及其冻干粉，属于生物化学工程技术领域。具体包括步骤：(1)制备尿激酶粗品；(2)制备尿激酶精品；(3)提纯；所述步骤(3)中将步骤(2)得到的尿激酶精品溶解后，将尿激酶精品溶液加入阳离子交换层析柱进行提纯；将提纯后的尿激酶进行冻干即得到尿激酶冻干粉。所述阳离子交换层析柱中充填的填料为Capto S impAct、SP sepharose HP、source 30S中的一种。本发明选择高分辨率离子交换层析，在保证纯度和活性收率的前提下，大大降低了生产成本，使得高纯度大分子量尿激酶的规模化生产成为可能。

技术领域

本发明属于生物化学工程技术领域，具体涉及一种尿激酶的制备方法及其冻干粉。

背景技术

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它是无抗原性问题，可长时间使用。

尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种碱性蛋白，等电点在pH8.7左右，为白色非结晶状粉末，易溶于水；稀溶液性状不稳定，必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释，冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也有酯酶的活力，无抗原性，不使体内产生抗体，体内半衰期为(14±6)min。

尿激酶主要有大分子尿激酶(H-UK)、分子量为54000，和小分子尿激酶(L-UK)、分子量为34000两种，前者为天然存在形式，后者为H-UK的降解产物。这两种UK均有生物活性，但从体外进行的酶动力学试验和临床表明，H-UK比L-UK更有效、副作用更低，因此现阶段临床使用的尿激酶产品对小分子量尿激酶含量的控制有着严格要求。

自20世纪70年代以来，高纯度大分子量尿激酶的制取方兴未艾，精制方法多有报道，但大多数方法都存在回收率偏低的问题，经济效益差，无法实行量产。

中国发明专利申请CN105238772A(一种尿激酶分离纯化方法)中，将尿激酶进行分离和纯化，得到了去除内毒素的尿激酶溶液，具体为对男性尿液进行酸化，用硅藻土柱进行吸附，再用氨水和氯化钠溶液进行洗脱，然后对洗脱液进行盐析，得到尿激酶粗品，随后将尿激酶粗品加入氨水中解离，得到了尿激酶溶液；纯化过程中，将尿激酶溶液通过装有纤维素、离子交换树脂等凝胶填料的凝胶柱中，进行洗脱处理，即得到产品，这种方法避免了强酸强碱的使用，能够有效分离内毒素，得到收率在97％以上的尿激酶。然而这种方法不能实现对大分子尿激酶和小分子尿激酶的分离。中国发明专利申请CN101701215A(一种制备尿激酶的方法)采用D160阳离子树脂交换法、亲和膜色谱法及亲和层析法相结合，以尿激酶粗品出发，制备尿激酶，最终得到的尿激酶比活性可达15万IU/mg.pr以上，高分子尿激酶的相对含量可达96％以上，然而生物活性收率仅为65％，因此并不能满足当前阶段临床的实际需求，同时该方法中利用到的亲和膜色谱法生产成本较高，无法进行大规模生产。中国发明专利申请CN106929497A(一种尿激酶的分离纯化方法)中，将尿激酶粗品溶解后加入葡聚糖微球柱或琼脂糖微球柱中进行纯化，最终可将尿激酶比活性提高至2万IU/mg蛋白以上，得到的尿激酶的收率为75-87％，然而这种方法并未区分大小分子尿激酶，且活性收率较低，因此并不能满足当前阶段临床的实际需求。

发明内容

本发明欲解决的技术问题是现有技术的尿激酶生产和纯化方法中，生产成本高，并且不能确保得到的大分子量尿激酶同时具有高纯度和高活性收率等技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种尿激酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备尿激酶粗品；(2)制备尿激酶精品；(3)提纯；