[发明专利]副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法

说明书

本发明公开一种副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法，其包括步骤：(A)获取副干酪乳杆菌ZFM54；(B)细菌素效价的测定；(C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定；(D)发酵上清液的制备；(E)大孔树脂吸附层析；(F)离子交换色谱；(G)凝胶过滤层析；以及(H)制备型HPLC纯化，通过多步分离纯化方法得到副干酪乳杆菌ZMF54细菌素。

技术领域

本发明涉及菌种培养领域，更进一步，涉及一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法。

背景技术

目前商业化的乳酸菌素Nisin由于对热不稳定，抑菌谱较窄，能有效抑制革兰氏阳性菌但对大多数革兰氏阴性菌和霉菌等的生长没有抑制作用等原因，在食品工业中的应用受到限制。因此，开发广谱、高效的乳酸菌细菌素作为天然防腐剂已成为研究热点而备受关注。

副干酪乳杆菌常被用作牛奶、酸奶、奶油和干酪等乳制品的发酵剂及辅助发酵剂。细菌素一般定义为某些细菌在代谢过程中由核糖体合成的一类小分子蛋白质或多肽，这些物质在一定浓度下对其他微生物具有显著抑菌或杀菌活性。

揭示乳酸菌细菌素的生化特性、结构及作用机制对开发乳酸菌素资源与应用具有重要意义，这些都必须建立在获得乳酸菌纯品的基础上。迄今科研学者通过大量的产细菌素乳酸菌的筛选与研究已经发现了百余种乳酸菌素，但除了乳酸链球菌素Nisin第一个作为食品防腐剂应用于食品中外，真正商业化应用的乳酸菌素却很少，这是因为乳酸菌素的分离纯化难度较大，限制了乳酸菌素纯品的获得，使其难以深入研究和推广应用。因此，建立一个高效、快速的纯化流程是推动乳酸菌素研究及其在食品工业中应用的关键所在。由于乳酸菌细菌素是一类蛋白质或小分子多肽类物质，具有蛋白质的基本特性，所以一般蛋白质的纯化方法也可以为纯化乳酸菌素借鉴。而细菌素本身也有独特的理化特性如大多数带正电荷、疏水性较强等，因此需要结合其特异性选择合适的纯化方法。乳酸菌细菌素属于胞外分泌型代谢产物，但是由于发酵上清液中细菌素的浓度较低，直接分离纯化的难度较大，在检测阶段可能无法准确检出，因此一般先对发酵上清液进行粗提使其浓缩，再进行后续分离纯化。目前乳酸菌素的纯化流程已经比较成熟，主要分为粗提、中度纯化和精细纯化三个阶段。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其通过多步分离纯化方法，结合形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA同源性分析，鉴定筛选副干酪乳杆菌ZMF54。

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZMF54细菌素的分离纯化方法，其经过初筛获得了一株具有较广泛抑菌谱的乳酸菌菌株ZFM54，为了避免乳酸菌代谢产生的一些有机酸、过氧化氢等物质对抑菌效果产生的干扰，确定是细菌素类物质发挥的抑菌作用，并且进一步复筛对这些干扰因素做了逐一排除。

本发明的一个目的在于提供一副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其包括步骤：

(A)获取副干酪乳杆菌ZFM54；

(B)细菌素效价的测定；

(C)副干酪乳杆菌ZFM54产抑菌物质最适发酵条件的确定；

(D)发酵上清液的制备；

(E)大孔树脂吸附层析；

(F)离子交换色谱；

(G)凝胶过滤层析；以及

(H)制备型HPLC纯化。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：反相HPLC分析。

根据一个实施例所述的副干酪乳杆菌ZFM54细菌素的分离纯化方法，其进一步包括步骤：Tricine-SDS-PAGE方法检测细菌素的分子量。