[发明专利]一种组织工程后板层角膜的体外构建方法

说明书

本发明涉及一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，与带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在其后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。本发明攻克了人角膜内皮细胞在体外无法增殖的国际难题，角膜内皮细胞形成密度极高、连接紧密的单层内皮结构高达3400‑3600个细胞/mm²；接种角膜基质细胞采用注射接种法，既大大缩短了体外培养时间，又能保持载体支架结构的完整性。因此可满足高质量需求和低成本实现批量生产而得以推广应用。

技术领域

本发明属于再生医学组织工程领域的构建技术，具体涉及一种组织工程后板层角膜的体外构建方法。

背景技术

角膜位于眼球最前端，是人体唯一的免疫赦免区，无血管而呈现透明状，为眼睛提供大部分屈光力。角膜的组织结构由外到内依次为角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中角膜内皮层由单层、扁平、连接紧密的六角形内皮样细胞镶嵌而成，对维持角膜的透明度及正常厚度起着关键作用，并具有角膜-房水屏障功能。角膜中没有血管，只能经内皮层从房水中获取养分/氧气或透过泪液为上皮部分供养/氧。人角膜内皮细胞在成年后丧失了分裂能力，且以每年0.3%~0.6%的比例死亡。局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞的增大、扩展和移行来填补缺损区，以维持角膜内皮层的单层形态和功能。因此，在体外持续扩增培养人角膜内皮细胞是非常困难的，目前还属于国际难题。此外，白内障等手术损伤、长期高眼压（青光眼）、成形玻璃体持续接触角膜内皮、持续重度虹膜炎和严重虹膜前粘连等均可引起大量角膜内皮细胞的损伤与快速死亡，一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮生理功能的临界密度(600~800个/mm²)，角膜将出现不可逆病变，最终将引起角膜内皮失代偿；角膜基质层由200~250层规则排列的胶原板层和散在分布于其中的角膜基质细胞组成，在维持角膜厚度和透明度方面作用重大。在角膜受到深度创伤和感染时，往往会伤及深层角膜基质层和内皮层，即后板层角膜，轻者引起角膜水肿和角膜内皮失代偿，重者甚至致盲。就目前后板层角膜损伤的治疗方法主要是通过角膜基质层和内皮层分别进行多次的角膜移植手术，不仅增加了手术创伤和感染的风险，而且在角膜愈合以及移植区瘢痕残留方面尚存在诸多问题。因此，体外构建可用于移植的组织工程后板层角膜，以彻底解决供体角膜材料严重匮乏的现状，为治疗该类疾病开辟新的途径或材料构件是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程后板层角膜的构建方法，即在体外构建组织工程后板层角膜，以弥补现有技术和材料的不足。

本发明是基于我实验室已成功建立的非转染人角膜基质细胞系和人角膜内皮细胞系，并从中筛选出核型正常且结构功能正常的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，且成功解决了组织工程后板层角膜规模化构建所需足量正常种子细胞的来源问题。以及2014年樊廷俊等利用动物角膜成功制备出了透明性好、结构致密、机械性强、与角膜种子细胞生物相容性好、易于角膜种子细胞贴附和生长、适于批量生产的组织工程角膜载体支架（ZL201410459064.8）。就此尽早建立一种利用以角膜基质细胞和角膜内皮细胞作为种子细胞与上述载体支架进一步在体外构建组织工程后板层角膜，并且实现组织工程后板层角膜规模化生产及临床应用，是造福全世界角膜内皮层和基质层异常患者的关键。因此本发明是在已有技术的基础上，先后利用人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，或由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞，并接种于载体支架，实现体外构建出组织工程后板层角膜。

本发明的方法：包括已有的作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。