[发明专利]一种组织工程后板层角膜的体外构建方法

权利要求书

1.一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。

2.如权利要求1所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质种子细胞和角膜内皮种子细胞可以由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞替代。

3.如权利要求1所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征在于上述基质层部分的构建是首先用载体支架复水溶液对组织工程角膜载体支架进行复水，然后用构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成角膜基质细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的载体支架中，再加入构建专用培养液A后进行体外培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，得到组织工程后板层角膜的基质层部分；再用构建专用培养液C将人角膜内皮细胞制成角膜内皮细胞悬液后，将该细胞悬液接种于上述组织工程后板层角膜的基质层部分的后弹力层上进行体外培养，再将构建专用培养液C更换为构建专用培养液D进行培养，然后更换新的上述构建专用培养液D继续培养，即得组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜；

上述构建专用培养液A的配方是含有15%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白和0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液；

上述构建专用培养液B的配方是含有15%小牛血清、0.3-0.5mg/mL凝血酸、0.1-0.5mg/mL ε-氨基己酸、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液；

上述构建专用培养液C的配方是含有10%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白、0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子和0.01-0.02mg/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液；

上述构建专用培养液D的配方是20%小牛血清、0.2-0.4mg/mL氨基葡萄糖盐酸盐、0.1-0.5mg/mL ε-氨基己酸、30-50ng/mL人骨形态发生蛋白7、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液。

4.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质细胞悬液的制备方法：先取人角膜基质细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液培养至汇合单层后，再用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用上述构建专用培养液A重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为2×10⁵-6×10⁵个细胞/毫升，即得均质的角膜基质细胞悬液。

5.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜内皮细胞悬液的制备方法：先取人角膜内皮细胞，用含15%-20%小牛血清的DMEM/F12培养液培养至汇合单层后，再用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、离心收集细胞沉淀，最后再用上述构建专用培养液C重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×10⁵-5×10⁵个细胞/毫升，即得均质的角膜内皮细胞悬液。

6.如权利要求3所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的载体支架中，再加入构建专用培养液A后进行体外培养，然后更换构建专用培养液B继续培养的方法：是用微量注射器吸取上述角膜基质细胞悬液，在每个载体支架上均匀注射6-9针，每针1-2微升，后弹力层面朝上置于48孔板中，然后加入上述构建专用培养液A，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中，每隔12-24小时更换上述构建专用培养液B一次，持续培养48-96小时后，即得组织工程后板层角膜的基质层部分。