[发明专利]一种捕获肠癌循环肿瘤细胞的方法

说明书

本申请公开了一种从生物体液富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，其包括如下步骤：1)任选地将所述生物体液，例如血液通过物理分离方法如尺寸分离过滤去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞和血浆蛋白；2)任选地通过与特异性结合一种或多种白细胞生物标记如CD45、CD16、CD66b的一种或多种结合剂接触去除白细胞；3)通过与特异性结合A33的结合剂接触形成A33结合剂与循环肿瘤细胞的复合物。本申请还公开了所述特异性结合A33的结合剂用于制备结直肠癌循环肿瘤细胞的富集、分离或检测试剂的用途，以及包含所述A33结合剂的试剂盒。

技术领域

本申请涉及肿瘤细胞的富集，更具体地，本申请涉及循环肿瘤细胞(CTC)的富集。

背景技术

结直肠癌(Colotectalcancer,CRC)是胃肠道恶性肿瘤中常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌，分别居于第三位和第四位。当结直肠癌病变局限于肠壁时，通过外科手术切除病灶，约70％-80％的病人能够治愈，其5年生存率约为90％；但淋巴结转移的患者5年生存率则锐减到60％。目前由于结直肠癌的早期诊断依旧困难，相当一部分患者就诊时就已经发生转移，所以结直肠癌的早期诊断及治疗具有非常重要的临床意义。

随着“精准医疗”概念的提出，恶性肿瘤的诊断与治疗也逐步向个体化、精细化方向深入发展，循环肿瘤细胞(CTC)的研究是精准医疗的重要方向之一，而如何从恶性肿瘤患者血液中分离的CTCs中得到更多的诊断信息和治疗信息将是精准医疗的重要方面。传统的影像学与病理学不能及时的提供精确的预后信息，CTCs作为一种无创液体活检标志物，可弥补影像学与病理学的缺陷，对肿瘤预后评估、实时监测疗效、肿瘤复发监测等具有重要指导意义。

由于CTCs在外周血中每10⁶-10⁷个单核细胞中才发现1个CTC，因此对CTCs检测技术的灵敏度和特异度均提出了极高要求。

免疫磁性分离技术是目前最常用CTCs分离和富集技术。其原理是基于CTCs主要表达上皮源性表面标志，利用抗原抗体方法分离和富集CTCs，具体分为阳性富集方法和阴性富集方法。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子(Eepithelial Cell Adhesion Molucule,EpCAM)和细胞角蛋白(Cytokerins,CKS)等标志物直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志物，去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞，但是此方法得到的循环肿瘤细胞纯度为17％-51％。

目前基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪(magnetric cell sorting，MACS)、AdnaTest癌细胞检测系统和莱尔系统等。CellSearch系统是目前唯一获得美国食品与药品管理局(FDA)的批准用于临床监控乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌根治术后肿瘤复发的新技术。该系统集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，通过包被有抗EpCAM的特异性抗体的纳米磁颗粒在磁性区域捕获CTCs，通过三重染色过程使CTCs区别于血细胞，包括用荧光素标记CD45的抗体来标记白细胞，用荧光素标记角蛋白(CK)的抗体来标记CTCs及用DAPI对细胞核进行染色，并将CD45呈阴性、CK呈阳性、EpCAM呈阳性的细胞定义为CTCs。CellSearch系统的优点是细胞形态结构能够较好保存，即通过荧光显微镜看到荧光染色的结果，直接观察到肿瘤细胞的形态。

但CellSearch系统也存在明显的技术缺陷：1.检测灵敏度低。血液中CTC含量过低，或者因上皮间质转换导致EpCAM抗原丢失，因此该检测存在假阴性率较高的问题。2.因EpCAM蛋白为上皮型细胞表面标志物，不具有组织特异性，因此无法判断CTC组织来源。3.没有对捕获的CTC进行深入分析，只能提供细胞数目技术，而没有进行如蛋白表达，基因表达变化和药敏实验等的应用技术。