[发明专利]一种大引物PCR定点突变的方法

说明书

本公开提供了一种大引物PCR定点突变的方法，所述方法的操作步骤为：(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。所述方法中在设计突变引物时，是将突变位点设计于突变引物序列的中间位置，这样使得在后续PCR反应中，有利于突变引物与模板的结合，从而提高了突变率。

技术领域

本公开涉及基因工程技术领域，具体涉及一种大引物PCR定点突变的方法。

背景技术

定点诱变(site-directed mutagenesis,SDM)是阐明基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系的不可缺少的研究手段。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于在生物体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA经高温(95℃～98℃)加热一定时间后，DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA会解离打开成为单链DNA片段将作为模板；反应温度随即降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列通过碱基配对结合；在DNA模板与引物结合后，Taq DNA聚合酶会结合其上，并以靶序列为模板，以dNTP为底物，按照碱基互补配对和半保留复制的原则，合成一条新的与模板DNA链互补的单链DNA。

相对其它基于PCR的定点诱变方法而言，大引物(megaprimer)PCR定点诱变技术因简便实用而广受欢迎。经典的大引物需要2条侧翼引物和1条突变引物进行两轮PCR反应。即以第1轮PCR中产生的含点突变的产物做引物进行第2轮PCR反应，再以所得产物为模板及作为大引物进一步扩增以提高突变基因的得率，一般也需要对原始模板进行酶消化以避免原始基因干扰，第一轮PCR和第二轮PCR之间进行胶回收得到大引物片段。许多国内外学者对其进行了改进和优化，使得整个过程可以在单管中进行并不需要凝胶回收大引物片段。有的学者设计分别缺少正向或反向侧翼引物可结合的互补序列的两个不同质粒作为模板，中间大引物无需纯化，可完全避免了对野生型全长质粒的扩增。有的学者使用抗性不同的模板载体和突变基因载体，防止野生型质粒干扰。但这些改进方法仍受PCR反应条件的影响在产生过长的大引物后突变成功率不高，突变效率不能达到100％。

发明内容

本公开的目的是提供一种大引物PCR定点突变的方法，以达到提高突变率的目的。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种大引物PCR定点突变的方法，所述方法的操作步骤为：

(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；

(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；

(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；

(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。

所述侧翼引物的退火温度在50-75℃之间，所述侧翼引物以碱基G或C结尾。

所述突变引物的序列以碱基G或C结尾，所述突变引物序列中的GC含量在40％-60％之间。

所述第一步PCR的反应条件为：首先是95℃-98℃预变性90s-100s；然后95℃-98℃变性20s-30s，50℃-55℃退火10s-20s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环20-22次；最后70℃-75℃延伸4min-6min。