[发明专利]一种大引物PCR定点突变的方法

权利要求书

1.一种大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述方法的操作步骤为：

(1)根据目的基因序列设计引物，得到两个侧翼引物，分别为上侧翼引物和下侧翼引物；

(2)根据突变碱基所处序列位置设计突变引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；

(3)由突变引物与距突变位点较远的侧翼引物进行第一步PCR反应得到大引物；

(4)将得到的大引物中加入两个侧翼引物进行第二步PCR扩增，得到突变目的基因序列。

2.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述侧翼引物的退火温度在50-75℃之间，所述侧翼引物以碱基G或C结尾。

3.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述突变引物的序列以碱基G或C结尾，所述突变引物序列中的GC含量在40％-60％之间。

4.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第一步PCR的反应条件为：首先是95℃-98℃预变性90s-100s；然后95℃-98℃变性20s-30s，50℃-55℃退火10s-20s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环20-22次；最后70℃-75℃延伸4min-6min。

5.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第二步PCR的反应条件为：首先95℃-98℃预变性90s-100s；然后95℃-98℃变性20s-30s，65℃-68℃退火20s-30s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环8-10次；然后95℃-98℃变性20s-30s，50℃-55℃退火20s-30s，70℃-75℃延伸20s-30s，循环20-22次；最后70℃-75℃延伸4min-6min。

6.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，PCR反应所使用的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。

7.根据权利要求书6中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第一步PCR反应的体系是DNA聚合酶预混试剂：突变引物：侧翼引物：目的基因序列模板DNA：无菌水的比例为10：1：1：0.5：7.5。

8.根据权利要求书6中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第二步PCR反应的体系是DNA聚合酶预混试剂：上侧翼引物：下侧翼引物：大引物：无菌水的比例为25：0.5：0.5：13：11。

9.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第一步PCR反应所使用引物的浓度为4μM。

10.根据权利要求书1中所述的大引物PCR定点突变的方法，其特征在于，所述第二步PCR反应所使用引物的浓度为20μM。