[发明专利]基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法

说明书

本发明公开了基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶‑1（PARP‑1）单粒子检测方法，本发明还公开了一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒。基于纳米粒子散射光谱位移的变化实现了对PARP‑1活性的定量检测和在单粒子水平上对细胞内的PARP‑1进行暗场成像，从而显著区分癌细胞和正常细胞。本发明通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个等离子纳米粒子的暗场成像和散射光谱的采集，相比传统的平均测量手段具有更高的检测灵敏度。本发明的试剂盒具有免标记、检测灵敏度高、空间分辨率较高等优点。

技术领域

本发明生物技术领域，具体涉及基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)单粒子检测方法。

背景技术

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)是一类广泛存在于真核细胞中的多功能蛋白质翻译后修饰酶，参与DNA的复制和转录、并维持基因组稳定。据报道，PARP-1是PARP家族成员之一，在碱基切除修复进程中占据核心功能，是DNA损伤的分子感应器，当DNA出现链内或链间交联、单/双链断裂或损伤时，PARP-1被激活，活化的PARP-1能结合形成同源二聚体并催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)分解为烟碱和ADP核糖元，将聚ADP核糖聚合物(PAR)产生到靶蛋白上。一旦表面带有大量负电荷的PAR形成，受体蛋白的电荷性质则发生显著改变，引发DNA损伤控制和修复过程。许多研究表明PARP-1在多种恶性肿瘤细胞中过度表达使其成为癌症治疗的潜在靶点，因此开发高灵敏、高特异性的PARP-1活性检测方法至关重要，对于今后癌症的临床诊断和相关药物筛选具有重大意义。

基于激活的PARP-1催化NAD⁺生成支状聚合物PAR的过程，PARP-1活性可通过NAD⁺的消耗量或者PAR的生成量来测定。传统的PARP-1检测方法主要有：酶联免疫法，蛋白质印迹法，化学定量NAD⁺，放射性标记NAD⁺等方法。这些方法虽然具有很高的灵敏度，但是实验过程比较长，操作也比较复杂，往往需要放射性标记底物，所以检测费用通常也比较高。

目前发展了一系列基于总体测量的PARP-1活性检测策略，包括比色法、荧光光谱法、电化学法和石英晶体微量天平(QCM)法，但是上述检测方法无法在单粒子水平上检测PARP-1活性以及在活细胞中对PARP-1进行成像，因此实际应用有限。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)单粒子检测方法。本发明将Au₅₀作为散射探针，PARP-1被激活、催化生成PAR，通过静电相互作用，许多正电Au₈被吸附在Au₅₀表面上，改变了Au₅₀周围的介电环境，导致其散射光颜色和LSPR散射光谱均发生显著变化，通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个Au₅₀的暗场成像和散射光谱的采集，与传统的PARP-l检测方法(酶联免疫法，蛋白质印迹法，化学定量NAD⁺，放射性标记NAD⁺等)相比，本发明无需对NAD⁺进行标记；且相比传统的平均测量方法(比色法、荧光光谱法、电化学法和QCM法等)具有更高的检测灵敏度，检测限降低了约两个数量级。本发明具有免标记、检测灵敏度高、空间分辨率较高等优点。

技术方案：我们利用暗场显微镜(DFM)建立了一种免标记的光谱分辨单粒子检测方法，这种方法不仅可以体外检测PARP-1活性，还能对活细胞内的PARP-1进行成像。通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个等离子纳米粒子的暗场成像和散射光谱的采集，相比传统的平均测量手段具有更高的检测灵敏度和空间分辨率。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，所述检测方法包括以下步骤：