[发明专利]基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法

权利要求书

1.基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

1 ） Au₅₀的制备；

2 ） Au₅₀-dsDNA的制备；

3）Au₈的制备；

4）在Au₅₀-dsDNA中加入NAD⁺和含有PARP-1的待测溶液中扩增，然后取样滴加在氨基功能化的玻璃片上，静电吸附后，洗去未结合的探针，加入过量的Au₈，静电吸附后，洗去未结合的Au₈，在暗场显微镜下采集图像和利用光谱仪采集单粒子的光谱曲线，根据位移的变化来确定PARP-1的浓度；

所述Au₅₀-dsDNA的合成步骤如下：

A1）首先，将BSPP加入到Au₅₀溶液中，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物离心后，沉淀复溶于超纯水，向溶液中加入少量BSPP，摇晃均匀后获得Au₅₀-BSPP；

A2）其次，将Au₅₀-BSPP与s-DNA混合，然后在室温下轻轻搅拌后，每隔3 h加NaCl，使其最终盐浓度达到150 mM得到Au₅₀溶液；

A3）将SH-PEG-800加入上述Au₅₀溶液中并孵育1h，然后加入c-DNA轻轻摇晃2 h，最后进行离心得到Au₅₀-dsDNA；所述s-DNA和c-DNA序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au₅₀的合成步骤如下：

S1）通过柠檬酸三钠还原法制备粒径为13nm的金纳米粒子：将柠檬酸三钠溶液快速加入搅拌中且沸腾的氯金酸溶液，混合溶液颜色依次从黄色到无色，再变为黑色、紫色，最终为酒红色，继续搅拌并保持沸腾，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中储存备用；

S2）通过种子生长法制备粒径为50nm的金纳米粒子：将超纯水、新鲜制备的Au₁₃、NH₂OH·HCl溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液依次加入圆底烧瓶中，然后室温下将氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌，停止搅拌后室温放置，最后所制得的Au₅₀于4℃冰箱中储存备用。

3.根据权利要求1所述基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au₈的合成步骤如下：

B1）将氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵在室温下连续搅拌；

B2）滴入硼氢化钠，溶液颜色由藏红花黄色变为橙红色，表明成功制备了Au₈。

4.一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Au₅₀-dsDNA、NAD⁺和Au₈。

5.根据权利要求4所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括氨基功能化的玻璃片。

6.根据权利要求4所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述NAD⁺浓度为1-10μM。

7.根据权利要求4~6任一项所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述癌细胞为卵巢癌A2780细胞或人乳腺癌MCF-7细胞。