[发明专利]一种重组人神经生长因子的制备方法

说明书

本发明提供了一种重组人神经生长因子的制备方法，杂质少，纯度高，生物活性好，可以作为治疗药物，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程范畴，涉及用基因工程方法制备高纯度、高活性、无修饰的重组人神经生长因子。

背景技术

Oxervate(cenegermin，重组人神经生长因子，rhNGF)是意大利制药商Dompé原研的一款滴眼液，是一种用于中度至重度神经营养性角膜炎(neurotrophic keratitis，NK)成人患者的治疗的孤儿药，目前已在欧盟和美国上市。另外，其用于治疗阿尔兹海默症的适应症也在研发中。

为了制备重组人神经生长因子，原研厂商首先表达proNGF包涵体，然后再变复性，纯化proNGF复性液，酶切纯化得到重组人神经生长因子。然而，该方法需要酶切，酶切后还需要纯化，步骤较多，过程较为繁琐。

因此，研究人员一直希望找到一种简单的、能够直接变复性的方法。Collins,etal.(US5,986,070)发明了一种rhNGF直接变复性的方法，其采用Tris作为缓冲液，在8M尿素条件下变性，在8M尿素条件下复性，这种方法获得了高活性的rhNGF。但是，这种方法获得的rhNGF经质谱测定，有许多分子量与rhNGF接近的杂质，这些杂质可能是rhNGF的修饰产物。由于修饰后的rhNGF和未修饰的rhNGF的分子量和性质都非常接近，这给后续分离纯化造成了困难，常规方法很难分开，即使分开，收率也较低。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种高纯度、高活性、无修饰的重组人神经生长因子的制备方法。本申请的发明人在对rhNGF的长期研究中发现，当采用碳酸氢铵(NH₄HCO₃)作为缓冲液，在尿素存在条件下变复性时，使用本发明的方法制备的重组人神经生长因子大大地减少了非目的蛋白的杂质，纯度高，生物活性好，可以作为治疗药物，具有良好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

本发明提供了一种重组人神经生长因子的制备方法，包括以下步骤：

(a)在大肠杆菌中表达并分离重组人神经生长因子的包涵体；

(b)使用包涵体洗涤液洗涤所述包涵体；

(c)加入变性液溶解所述包涵体；

(d)加入复性液进行包涵体复性；

(e)纯化获得重组人神经生长因子；

其中，所述步骤(d)采用碳酸氢铵作为缓冲液。

重组人神经生长因子的包涵体可以采用商业化的或已知的大肠杆菌蛋白表达系统进行表达并分离。根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(a)包括以下步骤：人神经生长因子氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，全基因合成人神经生长因子基因，插入载体，转化大肠杆菌，表达，碎菌，离心，收集沉淀。根据本发明的一个优选实施方式，所述载体为pET28a，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plyss，所述表达为IPTG诱导表达，所述碎菌为超声碎菌或匀浆机破碎等。