[发明专利]一种重组人神经生长因子的制备方法

权利要求书

1.一种重组人神经生长因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在大肠杆菌中表达并分离重组人神经生长因子的包涵体；

(b)使用包涵体洗涤液洗涤所述包涵体；

(c)加入变性液溶解所述包涵体；

(d)加入复性液进行包涵体复性；

(e)纯化获得重组人神经生长因子；

其中，所述步骤(d)采用碳酸氢铵作为缓冲液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)包括以下步骤：人神经生长因子氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，全基因合成人神经生长因子基因，插入载体，转化大肠杆菌，表达，碎菌，离心，收集沉淀。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pET28a，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plyss，所述表达为IPTG诱导表达，所述碎菌为超声碎菌或匀浆机破碎。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)包括以下步骤：使用包涵体洗涤液A重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，其中，所述包涵体洗涤液A包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，0.5-3％Triton X-100，pH 8.0-8.5；使用包涵体洗涤液B重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，其中，所述包涵体洗涤液B包括20-100mM Tris，50-150mMNaCl，1-10mM EDTA，1-4M尿素，pH 8.0-8.5；再使用包涵体洗涤液C重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，其中，所述包涵体洗涤液C包括20-100mM Tris，50-150mM NaCl，1-10mM EDTA，pH8.0-8.5。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)包括以下步骤：使用包涵体洗涤液A重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次，其中，所述包涵体洗涤液A包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，pH 8.5；使用包涵体洗涤液B重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次，其中，所述包涵体洗涤液B包括50mMTris，100mM NaCl，5mM EDTA，2M尿素，pH 8.5；再使用包涵体洗涤液C重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次，其中，所述包涵体洗涤液C包括50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)包括以下步骤：在包涵体中加入变性液，所述变性液包括8M尿素和15-25mM柠檬酸，pH 2.8-3.2，所述包涵体与所述变性液按照湿重：体积为1：20-30比例加入变性液，溶解后离心去除沉淀。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述变性液包括8M尿素和20mM柠檬酸，pH3.0，所述包涵体与所述变性液按照湿重：体积为1：25比例加入变性液。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)包括以下步骤：在变性液中加入1/4体积0.8-1.0M碳酸氢铵pH8.0-9.0和8M尿素溶液，加入DTT至终浓度为5-10mM，25-37℃30-60min；再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度为20-40mM，25-37℃10-15min；再加入19倍体积稀释缓冲液，所述稀释缓冲液包括50-150mM Na₂HPO₄，5-15mM乙醇胺，4.2-4.6M尿素，14-18％PEG300，pH8.3-8.5；再加入半胱氨酸至终浓度为1-5mM；用氩气赶出空气，4℃复性1-7天；用3K膜超滤浓缩复性液至rhNGF终浓度为1-2mg/ml。