[发明专利]一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用

说明书

一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明经筛选得到一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18517。此细胞株分泌的单克隆抗体，对双咪苯脲具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为2ng/mL），可实现对牛肉、猪肉和饲料中双咪苯脲残留量的检测，为食品中双咪苯脲残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

双眯苯脲（Imidocarb，IMI）又名咪唑苯脲，是当今国际公认的抗焦虫病药物，具有疗效高、毒性低、剂量小的特点。对牛、羊严重感染的巴贝西焦虫病，用咪唑苯脲治疗，病情可迅速得到控制，治疗三个月后未见复发。该品对焦虫病也有预防作用。临床资料还证实，该药对牛的锥虫病、附红细胞体病和人工感染的猪伊氏锥虫病、附红细胞体病疗效确实，并能控制疫情，但不能彻底杀灭附红细胞体。

双咪苯脲已被广泛应用于猪、牛养殖和饲料等领域。因此双咪苯脲在牛肉、猪肉和饲料中一般都有一定的残留，而人体摄入双咪苯脲过多对人类的肝肾等器官会造成代谢负担，若在动物蛋白（牛肉、猪肉、牛奶）中，有双咪苯脲残留，则有害于人类健康。世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会规定双咪苯脲在牛的肌肉和乳中的限量为50μg/kg。但是这些标准都采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对IMI的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对双咪苯脲的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对双咪苯脲具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立双咪苯脲的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18517。

双咪苯脲单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.18517的分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S分泌产生。

所述双咪苯脲单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中双咪苯脲残留的分析检测。

本发明提供的双咪苯脲单克隆抗体杂交瘤细胞株A11S的制备基本步骤为：

（1）半抗原的选择：所述半抗原的结构简式如下：

；

具体采用双咪苯脲原药衍生出2-（3-氨基苯）咪唑啉；反应方程式如下：

；

（2）完全抗原IMI-BSA的制备：称取4.38mg IMI衍生物，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺DMF中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL、浓度为1M的HCl进行酸化0.5h，得到酸化好的IMI衍生物溶液；再称取150mg 亚硝酸钠，用500μL 纯水充分溶解得到亚硝酸钠溶液；将5.56μL亚硝酸钠溶液加入到酸化好的IMI衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1h，称为A液；取6mg BSA，用2mL 0.01M、pH=9.0的碳酸盐缓冲溶液CB溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原IMI-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；