[发明专利]一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法

说明书

本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶的方法，包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤；所述特征肽段包括特征肽段1：SISNNEQVK和特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR。本发明所提出的意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中α‑葡萄糖苷酶，可用于辅助意蜂蜜真实性评价。该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法，该方法适用于意蜂蜜的真实性的鉴别与评价。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。为了追逐巨额利润，不法商贩在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序，侵害了消费者权益。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。

意蜂，来源于意大利，与中蜂之间无法杂交繁殖。意蜂相比于中蜂个体大，背部黄，但是适应性差，易发病。意蜂蜜及中蜂蜜中同样含有α-葡萄糖苷酶，但在这两种蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列不同。α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。葡萄糖苷键的成键方式分为α-型与β-型两种，意蜂蜜中所含有的葡萄糖苷酶为α-葡萄糖苷酶。

液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列特异于的胰蛋白酶特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略的基础上，提出本发明。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法。

该方法可用于生产和商业中对意蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。

第一方面，本发明筛选出可用于液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的特征肽段组：

特征肽段1：SISNNEQVK，用于定量，

特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，用于定性。

本发明成功筛选出意蜂特征肽段1：SISNNEQVK，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR，其中特征肽段1：SISNNEQVK可以作为定量肽段，特征肽段2：IYTHDIPETYNVVR可以作为定性肽段，两者特异性通过Uniprot数据库进行了验证；本发明同时设计特征肽段相对应的稳定同位素内标（IS）肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量α-葡萄糖苷酶。

优选地，所述稳定同位素内标肽段为：SISNNEQVK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为¹³C，氮置换为¹⁵N。

进一步，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有509.76182质荷比；包含质荷比为713.36824、818.40027的子离子。

所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z: 513.76642，同时包含质荷比为1088.52023、858.45036的子离子。