[发明专利]用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法。本发明试剂盒包括一对扩增引物，所述扩增引物用于作为检测基因突变高发区多个突变位点的通用PCR扩增的上游引物和下游引物，其扩增区域包括待检测的基因突变高发区；针对基因突变高发区的野生型特异性检测探针，针对所述基因突变高发区的扩增区域中基因保守序列的内对照探针，所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针标记不同荧光染料。本发明试剂盒和方法可以区分基因突变高发区野生型和突变型，并可根据探针阳性信号位置进一步确定具体突变型别，并且可以实现对各种不同突变型别进行定量，确定各种突变的比例。

技术领域

本发明涉及数字PCR领域，尤其涉及用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法。

背景技术

基因突变是指细胞中的遗传基因(通常指脱氧核糖核酸，DNA)发生的改变。基因突变包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入。基因突变是由于细胞分裂时基因的复制发生错误、或受化学物质、基因毒性、辐射或病毒的影响而造成。在一个基因上可以存在多个位点的突变，某些位置存在多个相近或相邻的突变位点，这个区域则称为突变高发区。例如，这种突变高发区包括：表皮生长因子受体EGFR基因 19外显子第746-752位密码子的多种缺失突变。通常，突变高发区具有显著临床意义，与疾病的发生、药物靶点敏感性和耐用性密切相关。随着精准医疗的到来，会有更多的高发区基因突变被研究，并能够指导患者选择更佳的治疗方案。

随着数字PCR发展，数字PCR技术在突变检测中凸显出极大优势，该技术通过微流控芯片可生成数微米到数百微米的液滴，液滴的体积通常为皮升到纳升级别，可以包裹单分子。微液滴是由惰性油相通过生物相容性的表面活性剂包裹水相而产生，常见的生物化学可以在微液滴中实现。其技术优势如下：(1)灵敏度高，一个液滴可包含单个分子或细胞，在物理层面实现单分子级检测；(2)绝对定量，每次微流体芯片可生成数百万个微液滴，对逐个微液滴统计，通过泊松分布计算模板数量，可实现数字化绝对定量，结论可靠。目前，基于微液滴技术的研究工作和各种应用领域已发表在Cell、Nature、Nature Biotechnology、PNAS等高水平杂志上。

基因突变高发区突变检测一直是突变检测的一个难点，现有各种检测技术都无法通过一次检测实现基因突变高发区各种突变类型的检测以及各种突变类型的定量检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：a.一对扩增引物，所述扩增引物用于作为检测基因突变高发区多个突变位点的通用PCR扩增的上游引物和下游引物，其扩增区域包括待检测的基因突变高发区；b.针对基因突变高发区的野生型特异性检测探针，所述野生型特异性检测探针与所述基因突变高发区的野生型序列特异性结合，而与突变型序列为非特异性结合；c.针对所述基因突变高发区的扩增区域中基因保守序列的内对照探针，所述内对照探针检测的保守序列同样位于所述一对扩增引物的扩增区域之间，与所述野生型特异性检测探针检测的序列位于同一个扩增区域；所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针标记不同荧光染料，从而实现利用数字PCR的数据分析中的二维散点图区分液滴中不同荧光信号位置，达到对所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针识别，区分基因突变高发区是否具有突变和/或突变类型。

在一种实施方式中，所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针检测的序列在同一条核酸链上，或者在不同的核酸链上。

在一种实施方式中，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因19 外显子缺失突变的试剂盒。