[发明专利]用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法

权利要求书

1.用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

a.一对扩增引物，所述扩增引物用于作为检测基因突变高发区多个突变位点的通用PCR扩增的上游引物和下游引物，其扩增区域包括待检测的基因突变高发区；

b.针对基因突变高发区的野生型特异性检测探针，所述野生型特异性检测探针与所述基因突变高发区的野生型序列特异性结合，而与突变型序列为非特异性结合；

c.针对所述基因突变高发区的扩增区域中基因保守序列的内对照探针，所述内对照探针检测的保守序列同样位于所述一对扩增引物的扩增区域之间，与所述野生型特异性检测探针检测的序列位于同一个扩增区域；所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针标记不同荧光染料，从而实现利用数字PCR的数据分析中的二维散点图区分液滴中不同荧光信号位置，达到对所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针识别，区分基因突变高发区是否具有突变和/或突变类型。

2.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针检测的序列在同一条核酸链上，或者在不同的核酸链上。

3.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测以下等位基因的突变位点的试剂盒：del9(2235_2248>AATTC)，del9(2238-2248>GC)，del9(2239-2247)，del9(2239-2248>C)，del12(2235_2251>AATTC)，del12(2237-2253>TTGCT)，del12(2238_2252>GCA)，del12(2239-2251>C)，del12(2240-2251del12)，del12(2235-2246del12)，del15(2233-2247del15)，del15(2235_2252>AAT)，del15(2235-2249del15)，del15(2236-2250del15)，del15(2237-2251del15)，del15(2237_2252>T)，del15(2238-2252del15)，del15(2239_2256>CAA)，del15(2239-2253del15)，del15(2240-2254del15)，del18(2235-2255>AAT)，del18(2236-2253del18)，del18(2237_2257>TCT)，del18(2237-2254del18)，del18(2237-2255-T)，del18(2238-2255del18)，del18(2239-2256DEL18)，del18(2239-2258>CA)，del18(2240-2257DEL18)，和del24(2253-2276del24)。

5.根据权利要求4所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物对是上游引物SEQ ID NO：1:ACCCCCACACAGCAAAGC，下游引物SEQ ID NO：2：TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC；所述内对照探针和所述野生型特异性检测探针分别是SEQ IDNO：3:CCAGAAGGTGAGAAAG；和SEQ ID NO：4:C+C+C+GT+C GCT ATC AA+G+GAATTAA，其中“+”为锁核酸碱基。

6.根据权利要求5所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内对照探针5'端用FAM进行荧光标记，所述野生型特异性检测探针5'端用VIC进行荧光标记。

7.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照是含有待测突变位点的质粒DNA样本与商品化正常人基因组DNA混合后制备，所述阴性对照是商品化正常人基因组片段化DNA。