[发明专利]解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使解脲脲原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用。

背景技术

解脲脲原体(M.urealyticum，UU)是介于细菌与病毒之间的最小原核生物，无细胞壁，能利用自身尿素酶分解尿素以提供代谢能源。根据其表型、遗传和分子生物学特征，14个标准血清型可分为两个生物群：生物1群包括1、3、6、14共4个血清型；生物2群为其余10个血清型。致病菌以血清型1、3、6、14型为主，主要寄居于人体的泌尿生殖道。与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症有密切联系。男性泌尿生殖道解脲脲原体菌群的寄生率约为25％，女性泌尿生殖道解脲脲原体菌群的寄生率约为0-80％。解脲脲原体可引起患者非淋菌性尿道炎、宫颈炎、前列腺炎、不孕不育症等危害；孕妇感染，可危害母体健康、胎儿生存。解脲脲原体可存在于健康无症状的个体中，是一种条件致病微生物，在特定的环境下可以致病，其致病性与多种因素有关，如宿主免疫力、病原血清型或基因型等。

目前实验室常用的诊断UU感染的方法有很多，一般可以分为UU分离培养、免疫学方法和分子生物学诊断三种。UU分离培养是最传统的检测方法，需接种液体培养后再接种至固体培养基证实后镜检，该方法要求苛刻、阳性率低、耗时较长(约一周)，无法在临床上有效应用。免疫学方法主要有ELISA、胶体金免疫层析法等，优点是操作简单、特异性强；缺点是敏感度低、且泌尿生殖道病原体感染性疾病产生的抗体检测存在窗口期，在病原体感染初期不易检测到。分子生物学技术包括核酸杂交、分离、聚合酶链反应(PCR)、基因芯片技术、悬浮阵列技术等，它们普遍灵敏度高、特异性强、速度较快、甚至能高通量检测，但也常常遇到一些问题，如单一检测一种病原体，费时、费力、检测成本高，而多种病原体PCR检测效率不高；扩增产物DNA污染导致假阳性，且DNA非常稳定难以消除；实时PCR技术需要昂贵的荧光探针以及昂贵的检测仪器，检测成本高。因此，继续寻找一种操作简单、快速、低廉的UU病原体诊断方法是必要的。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使解脲脲原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl₂，70mM KCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM。其中扩增引物包括两对：解脲脲原体和人内参基因，具体如下：

(1)UU(多带抗原基因MBA序列)的扩增引物：