[发明专利]解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种解脲脲原体核酸检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1)扩增反应液：含40mM pH 8.0的Tris-HCl，12mM MgCl₂，70mM KCl，15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括两对：解脲脲原体和人内参基因，具体如下：

(1)UU的扩增引物：

UU-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTGGTTCACG WGGTAATT；其中，W＝A/T；

UU-F引物(5’-3’)：GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG；

(2)内参基因的扩增引物：

内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTT GCCCTCCA；

内参-F引物(5’-3’)：AGAAACGGCTACCACATCC；

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；3)细胞裂解液；

4)检测液：含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、C线显色探针；每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

(1)UU的特异探针，

UU-CES1(5’-3’)：GTTTTCGTTAAAATTAAAAttttTATCTATAGCTGGTG T；

UU-CES2(5’-3’)：ATAAATGAAATTATTAAAAAATAAttttTATCTATAG CTGGTGT；

UU-LES1(5’-3’)：TGAAAAYAAAACAGAAAttttCGCAGTGCTCGAGC TCTGAGC；其中，Y＝T/C；

UU-LES2(5’-3’)：GTTTACGAMATTGAAAAttttCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC；其中，M＝A/C；

UU-LES3(5’-3’)：TGCAMTTACATCAGYTGAAAAttttCGCAGTGCTCG AGCTCTGAGC；

(2)内参特异探针

内参CES1(5’-3’)：AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参CES2(5’-3’)：GCGCAAATTACCCACTttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参LES1(5’-3’)：CCCGACCCGGGGAGGTttttCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC；

内参LES2(5’-3’)：AGTGACGAAAAATAACttttCGCAGTGCTCGAGCTC TGAGC；

内参LES3(5’-3’)：AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCT CTGAGC；

(3)C线显色探针(5’-3’)

TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

(4)金探针

金探针5’端被巯基化修饰，序列为(5’-3’)：

CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCT CGAGCACTGCG；

5)试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从下往上依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上检测线有三条，从样品垫到吸水纸方向分别为UU-T线、内参-T线和C线；UU-T线处固定UU包被探针、内参-T线处固定内参包被探针、质控-C线处固定质控包被探针，具体序列(5’-3’)为：

UU包被探针：ACACCAGCTATAGATAttttACACCAGCTATAGATA；

内参包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；

C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为AMV或M-MLV。

3.权利要求1或2所述的试剂盒在制备解脲脲原体检测试剂中的应用。