[发明专利]一种生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用

说明书

本发明涉及一种生物传感器联合蛋白免疫反应在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，其特征在于，包括AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器和蛋白免疫反应；通过构建的AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，开展五味子甲素治疗少弱精子症信号通路体外检测实验，进一步联合蛋白免疫反应，开展五味子甲素治疗少弱精子症信号体内通路检测实验，发现五味子甲素是通过调节SCF/c‑kit通路发挥治疗少、弱精子症的作用；该检测方法特异性强，检测浓度低至pg/pM级，检测范围涵盖五个数量级，具有高灵敏度和强专属性。

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用。

背景技术

研究表明全世界大约5％的异性夫妇有不孕的问题。然而，更多的夫妇经历了至少一年的非自愿无子女：估计在12％到28％之间。男性不孕症占不孕症病例的20％-30％，据调查发现，近年来男性不育的发生率显著增高，最常见的原因是精液缺乏，其中由少、弱精子症导致的男性不育症高达60％，严重影响人们的家庭和谐和生活质量，是全球亟待攻克的关键难题。

针对少、弱精子症，现代医学虽开展了大量研究，但目前尚缺乏疗效确切的治疗药物。中医药基于整体观和辨证论治思想治疗男性不育症历史悠久，疗效确切。中医男科学奠基人之一王琦院士提出少、弱精子症的核心病机为“肾虚挟湿热瘀毒虫”，并根据此病机提出了“补肾益精、清热利湿、活血化瘀”的治疗原则，基于此创研了我国第一个专门治疗男性不育症的生精方药“黄精赞育胶囊”。临床结果显示，该药能增加精子数量，提高精子活力，对于少、弱精子症引起的男性不育症疗效显著。前期研究表明，其有效成分五味子甲素具有提高精子活力的作用，有望开发低毒高效的生精药物，但其作用机制仍待进一步研究。

目前常用于检测信号通路的方法为蛋白免疫反应方法，但是单独使用该方法缺乏对作用机制的直观表征。高电子迁移率晶体管(High Electron Mobility Transistor,HEMT)作为第三代电化学型器件，以其更高的灵敏度和更强的专属性为分子间相互作用机制的识别提供了关键的前沿技术支撑。然而，联合生物传感器技术和蛋白免疫反应方法用于检测五味子甲素提高少、弱精子症样本精子活力的作用机制的研究仍为空白。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对单独体外实验缺乏可靠性，单独体内实验缺乏作用机制的直观表征问题，提供一种结合高灵敏度和强专属性的HEMT生物传感器的体外实验联合基于蛋白免疫反应方法的体内验证实验方法，解析五味子甲素提高少、弱精子症样本精子活力的作用机制。

本发明提供一种生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用，首先提供一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中应用，具体技术方案如下：

(1)构建c-kit-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器和SCF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器，具体制备步骤如下：

a将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于巯基试剂中，于室温下浸泡24小时，在AlGaAs/GaAs HEMT器件表面生成Au-S键，生成自组装单层；

b.用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂，加入碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液，反应15min，生成稳定的胺类活化产物以活化羧基；

c.用PBS清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件，加入络氨酸激酶(c-kit)或重组人干细胞因子(SCF)，于4℃下反应2h，即得c-kit-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器或SCF-AlGaAs/GaAsHEMT生物传感器；

(2)基于AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的五味子甲素治疗少弱精子症通路的检测方法，具体检测步骤如下：