[发明专利]一种生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用有效
申请号: | 201911316164.4 | 申请日: | 2019-12-19 |
公开(公告)号: | CN113009127B | 公开(公告)日: | 2023-07-07 |
发明(设计)人: | 吴志生;郑燕飞;马丽娟;李博怿 | 申请(专利权)人: | 北京中医药大学 |
主分类号: | G01N33/53 | 分类号: | G01N33/53;G01N33/68 |
代理公司: | 北京市诚辉律师事务所 11430 | 代理人: | 范盈 |
地址: | 102488 北京市房*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 生物 传感器 联合 蛋白 免疫 反应 方法 检测 五味子 治疗 精子 信号 通路 中的 应用 | ||
1.一种生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用,其特征在于,具体步骤如下:
(1)AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器的制备:
a.将干净的AlGaAs/GaAs HEMT器件置于含巯基试剂中,于室温下浸泡,在AlGaAs/GaAsHEMT器件表面生成Au-S键,生成自组装单层;
b.用去离子水洗去AlGaAs/GaAs HEMT器件表面的巯基试剂,加入羧基活化剂,生成稳定的胺类活化产物;
c.用磷酸盐缓冲液清洗AlGaAs/GaAs HEMT器件,加入络氨酸激酶c-kit或重组人干细胞因子SCF,反应完成,即得c-kit-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器或SCF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器;
(2)AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器在黄精赞育胶囊有效成分治疗少、弱精子症信号通路检测中的应用:
a.根据(1)所述方法制备c-kit-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器,依次加入浓度由低到高的重组人干细胞因子SCF溶液,采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度;以SCF蛋白溶液浓度的对数为横坐标,以电流变化相对值为纵坐标,进行线性拟合,进一步根据公式①、②和③计算SCF与c-kit相互作用强度;
b.根据(1)所述方法制备c-kit-AlGaAs/GaAs HEMT和SCF-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器,分别向两个传感器中依次加入浓度由低到高的五味子甲素标准品溶液,采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度;以五味子甲素标准品溶液浓度的对数为横坐标,以电流变化相对值为纵坐标,进行线性拟合,进一步根据公式①、②和③计算五味子甲素与c-kit和SCF相互作用强度;
步骤(2)中的a和b所述的公式如下:
其中[Ab]为c-kit的浓度,[Ag]为SCF/五味子甲素的浓度[C],K及KA为结合常数,KD为解离常数,ΔI为电流变化值,ΔImax为电流最大变化值;
c.根据(1)所述方法制备c-kit-AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器,依次加入浓度由低到高的重组人干细胞因子SCF和五味子甲素的混合溶液,采用电化学装置记录源极-漏极间的电流强度,考察五味子甲素对SCF/c-kit相互作用强度的影响,分析五味子甲素调节SCF/c-kit作用机制;
(3)蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中应用的具体步骤如下:
a.构建少、弱精子症动物模型,分空白对照组,五味子甲素高中低三个剂量组和左卡尼汀组给药,所有大鼠最后一次给药后,取静脉血后处死动物,取睾丸组织冻存;
b.切取睾丸组织,剪碎,加入磷酸盐缓冲液,于4℃离心,弃去上清液,加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解睾丸组织,4℃离心取上清液备用;
c.制作睾丸组织石蜡切片,通过免疫组织化学实验方法,观察各组大鼠睾丸组织蛋白表达情况;
d.以牛血清白蛋白溶液为标准液,采用酶标仪测定SCF抗体和c-kit抗体的蛋白浓度;采用电泳技术分离蛋白,经制胶、电泳、转膜、染膜及封闭步骤制备PVDF膜,加入信号通路涉及的蛋白的二抗溶液反应,通过Western Blot,结合数码凝胶图像分析系统分析蛋白表达情况;
e.结合基于睾丸组织免疫化学反应及基于Western Blot的蛋白表达结果,分析五味子甲素介导SCF/c-kit通路治疗少、弱精子症的机制。
2.权利要求1中所述的一种AlGaAs/GaAs HEMT生物传感器联合蛋白免疫反应方法在检测五味子甲素治疗少弱精子症信号通路中的应用,其特征在于,步骤(1)b中的羧基活化剂为碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺,活化时间为15-30min,修饰c-kit或SCF的反应温度为4℃,反应时间不低于2小时。
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