[发明专利]用于同时检测单纯疱疹病毒I型/II型胶体金层析试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了用于同时检测单纯疱疹病毒I型/II型胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物—特异探针—金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使单纯疱疹病毒I型和II型核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测单纯疱疹病毒I型/II型核酸的试剂盒及其应用。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的病毒性病原体。HSV主要通过直接接触传播，临床上约80％感染者表现为无症状感染，这是造成HSV流行的主要原因。HSV根据抗原性不同，可分为HSVI和HSVII两种血清型。HSVI主要引起腰部以上，如眼、口部的皮肤黏膜以及中枢神经系统的感染，症状较轻，易于治疗；HSVII主要引起生殖器部位的皮肤黏膜及新生儿感染，孕妇感染HSVII，会诱发胎儿发育异常或者流产。由于HSVII型感染容易复发，其用药周期会较HSVI感染长。因此，有必要对其进行分型检测，避免药物滥用。

HSV感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为直接涂片法、病毒分离培养法、血清学检测法以及PCR法。直接涂片法检测快速、费用低、结果直观，但是检测结果容易受到取样部位及病变时机的影响。病毒分离培养是HSV检测的金标准，该方法虽然可靠，但对实验条件要求高，耗时长(2到3周)，易污染，因此，该方法无法在临床上得到有效应用。血清学检测主要采用ELISA法检测血清中的抗原或者抗体，该方法特异性和灵敏度适中，简便快捷，也是现在临床上常用的检测方法，但存在难以解决的假阴性假阳性问题。PCR的方法可直接检测HSV的核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，但是PCR的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的单纯疱疹病毒诊断方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测单纯疱疹病毒I型/II型核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使单纯疱疹病毒I型/II型核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种单纯疱疹病毒I型/II型核酸联合检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl₂，70mM KCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM；其中扩增引物包括三对：I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒和人内参基因，具体如下：

(1)I型单纯疱疹病毒(UL30基因一段保守区序列)扩增引物：

HSVI-F(5’-3’)：CGTCGGGTCGGGCGGCTTCT；