[发明专利]用于同时检测单纯疱疹病毒I型/II型胶体金层析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种单纯疱疹病毒I型/II型核酸联合检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：

1）扩增反应液：含40 mM pH 8.0的Tris-HCl ，12 mM MgCl₂，70 mM KCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM；其中扩增引物包括三对：I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒和人内参基因，具体如下：

（1）I型单纯疱疹病毒扩增引物：

HSVI-F（5’-3’）：CGTCGGGTCGGGCGGCTTCT；

HSVI-R（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGTGTGATGGCGTCCATAAA；

（2）II型单纯疱疹病毒扩增引物：

HSVII-F（5’-3’）：CCACCGTCACCGTCTTCCAC；

HSVII-R（5’-3’）：AATACGACTCACTATAGGGAGAACCTCCGCCTTGTTCATGTAAA；

（3）内参基因的扩增引物：

18S-F（5’-3’）：AGAAACGGCTACCACATCC；

18S-R（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTTGCCCTCCA；

2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；

3）核酸提取试剂：细胞裂解液；

4）检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

（1）I型单纯疱疹病毒特异探针（5’-3’）

HSVI-CES1：GGCCGCGGCGCTCGCGCCTTTTTATCTATAGCTGGTGT；

HSVI-CES2：TGTGGGGCGGCGTGGACCTTTTTATCTATAGCTGGTGT；

HSVI-LES1：ACGCCCCGGCGGGGTTCATTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

HSVI-LES2：ACCCCACCGTCACCGTCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

HSVI-LES3：TTCACGTGTATGACATCCTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（2）II型单纯疱疹病毒特异探针（5’-3’）

HSVII-CES1: GCGTACAGCATGCGCGCCGCTTTTCTATGTATCTGTGAGT；

HSVII-CES2: CCAGCTCCACGAGCGATTTATTTTCTATGTATCTGTGAGT；

HSVII-LES1: TGGACGCCATCACGCCCGCCTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

HSVII-LES2: GGGACCGTCATCACGCTTCTTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

HSVII-LES3: GGGTCTGACCCCCGAAGGCCTTTTCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（3）内参特异探针（5’-3’）

内参 CES1: AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参 CES2: GCGCAAATTACCCACTttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参 LES1: CCCGACCCGGGGAGGTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

内参 LES2: AGTGACGAAAAATAACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

内参 LES3: AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（4）C线显色探针（5’-3’）

TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（5）金探针

金探针5’ 端被巯基化修饰，所述序列为：

5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGAGCACTGCG-3’ ；

5）试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有质控线C线和三条检测线T线，从样品垫到吸水纸方向分别为HSVII-T、HSVI-T、内参-T和C线；HSVI-T处包被HSVI包被探针、HSVII-T处包被HSVII包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列（5’-3’）为：

C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA；

内参线包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；

HSVI线包被探针：ACACCAGCTATAGATAttttACACCAGCTATAGATA；

HSVII线包被探针：ACTCACAGATACATAGttttACTCACAGATACATAG。