[发明专利]基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法

说明书

本发明涉及生物组织样本整体染色、三维成像领域，具体涉及一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法；该方法向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于的多聚甲醛溶液中固定；用缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗；将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；超声处理；超声漂洗；将石蜡块放在真空泵加热，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中，抽真，然后进行缓慢降温；将制作好的石蜡包埋样品置于在PBS缓冲液水槽中，利用TDI～fMOST相机进行采集。本发明借助超声加热的方式将Dil染料快速的渗透到组织内部，从而实现脏器组织大样本的整体染色。

技术领域

本发明涉及生物组织样本整体染色、三维成像领域，具体涉及一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法。

背景技术

Dil细胞膜红色荧光探针 (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)；DiI的分子式为C₅₉H₉₇ClN₂O₄，分子量为933.88是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光，最大激发波长549nm，最大发射波长565nm。Dil在细胞膜外呈现弱的荧光特性，与细胞膜或者单位膜结合后则呈现很强的荧光特性，并可沿着单位膜做侧向扩散，逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。它的荧光强而稳定，不影响被标记细胞的存活和生长，在标记细胞内消失慢，因此可以作为一种独特细胞膜(单位膜)标记物。作为神经科学研究领域中常用的荧光示踪剂，可以清晰揭露神经元精细的形态结构，如胞体、轴突、树突及树突棘等，Dil除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移、检测细胞毒性和标记脂蛋白。

Dil作为细胞膜荧光示踪剂的缺点：

Dil不足之处是染色扩散速度较慢，在活体的扩散速度平均为每天4～6mm，而在固定的脑组织中扩散速度仅为每天400μm，一般最大扩散距离仅10～12mm，因此Dil很难对整体生物组织样品进行快速的标记。

传统石蜡切片的缺点：

传统的石蜡切片后染色不仅效果不佳，还存在损失，轴向分辨率低，很难对切片再次进行三维重构，不能确保整体组织的完整性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于Dil 超声染色生物组织样本三维成像方法；该方法利用Dil染料能与膜结合后呈现很强的荧光特性，及其超声加热渗透的方法，对生物组织器官进行整体染色，利用TDI～fMOST成像对生物样本整体染色，连续切片断层成像的方法，其中的染色方法可以清晰的显示器官内部细胞层面立体的效果，具有快速、经济、高质量的特点。

为实现上述目的，本发明所设计一种基于Dil超声染色生物组织样本三维成像方法，包括以下步骤：

1)向小鼠心脏灌注后取出小肠；然后将小肠组织置于质量分数为3～5％的多聚甲醛溶液中固定6～24h；

2)用0.05～0.2M的PBS缓冲液对固定后的小肠组织进行漂洗 20～60min；漂洗2～4次；

3)将小肠组织分别置于不同体积分数的乙醇溶液中进行脱水；

4)然后将脱水的小肠组织置于无水乙醇配置浓度 0.1～0.3ug/mL Dil工作液中，在超声条件下进行超声处理；

5)将小肠组织置于无水乙醇中超声漂洗，重复2～4次；

6)将小肠组织置于二甲苯透明1～3次，每次0.5～2h；

7)将石蜡块放在真空泵加热到65～70℃，经双层滤纸过滤，将透明好的小组织浸在过滤后的石蜡中3～5h，抽真，然后进行缓慢降温；