[发明专利]一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法

说明书

本发明公开了一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法，属于分析化学技术领域。该方法以离子液体或离子液体与其它溶剂组成的二元混合溶剂为萃取剂，经液‑液萃取对生物样本进行前处理，然后采用高效液相色谱法进行检测，选择维生素A醋酸酯和反式‑β‑阿朴‑胡萝卜醛为脂溶性维生素和类胡萝卜素的内标，以保留时间和紫外可见吸收光谱为定性依据，内标法制作标准曲线定量。与现有方法相比，本发明前处理过程简单易操作，样品制备时间短，并减少了有毒有害有机溶剂的用量。该高效液相色谱分析方法分离效果好，检测精度高，可在40分钟内同时检测十种以上脂溶性营养素，高通量、低成本，易于临床推广及普及。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种同时测定血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素的方法。

背景技术

血清中的脂溶性营养素主要包括脂溶性维生素和类胡萝卜素类物质。脂溶性维生素主要包括维生素A、D、E和K，它们都含有环结构和长的脂肪族烃链，不溶于水或甘油，易溶于无水乙醇、甲醇、三氯甲烷、乙醚和油中。维生素A和E是常见的抗氧化剂，能防止细胞内不饱和脂肪酸等易氧化物质的氧化破坏，起到保护细胞膜不被破坏的作用。维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。维生素K是一类甲萘醌衍生物的总称，具有促进血液正常凝固等生理作用。类胡萝卜素是亲脂性异戊二烯类植物色素，存在于红色、黄色、橙色和深绿色的水果和蔬菜中。在自然界750多种类胡萝卜素中，约有15种存在于人体血清中，在血清中含量较高的有叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等。因化学结构中含有不饱和双键，类胡萝卜素是有效的抗氧化剂。许多脂溶性营养素参与与全身代谢密切相关的整体过程的稳态调节，包括氧化还原和炎症途径，是维持人体健康所必须的微量营养素。血清中脂溶性营养素含量的测定在营养学研究、癌症或非癌症相关疾病治疗的研究中至关重要。因此，开发快速和灵敏的方法来测量这些营养物质的血清浓度对于营养状况评估、营养不良诊断、干预方案制定和微量营养素可能涉及或改变的氧化或炎症反应研究等具有重要意义。

高效液相色谱法(HPLC)作为一种重要的分析技术，由于分离效率高、分析速度快、灵敏度高、所需试样量少等优点，为多种生化标记物的检测提供了新方法，越来越多地被应用于临床评价。专利CN105158394A、CN105372374A、CN109030648A、CN105891384B与CN105891384A公开了血清、奶粉或饲料中多种脂溶性维生素的定量分析方法。前处理过程采用乙醇沉淀蛋白，然后用正己烷或石油醚等溶剂萃取，收集萃取液吹干萃取剂后，用甲醇溶解后经液相色谱或液相色谱-串联质谱检测。该前处理过程步骤多，耗时长，易造成脂溶性维生素的氧化，并且有毒有害试剂的使用量大。专利CN108120788A、CN104749293A、CN107561171A、CN105717209A、CN103175934A以四氢呋喃、丙酮、正己烷、乙醚、乙酸乙酯等为萃取剂，采用液-液萃取的方式富集枸杞、黄肉桃、月季花瓣、辣椒叶片、草莓中的类胡萝卜素类物质，然后经液相色谱进行定量分析。前处理过程中有毒有害挥发性有机溶剂的用量较大，易污染环境。专利CN103175934A以C18色谱柱为固定相，而C18色谱柱对结构相似的类胡萝卜素及其同分异构体的分离效果有限，最为典型的情况是C18色谱柱无法分离互为同分异构体的叶黄素和玉米黄素，因此多将叶黄素和玉米黄素作为一个整体进行报道。而实际上叶黄素和玉米黄素在人体内分布区域不同，作用有别，因此分别测定二者的血清浓度将有助于研究其个体作用。专利CN108120788A公布了以C30色谱柱为固定相检测枸杞果实中叶黄素和玉米黄素含量的方法。但目前尚无专利公开同时检测血清中脂溶性维生素和类胡萝卜素含量的方法。

液-液萃取作为一种低成本、易操作的前处理技术，其核心在于萃取剂的选择。目前液-液萃取法富集血清中脂溶性营养素所用有机溶剂萃取剂与营养素的相互作用力较弱，萃取回收率低，需要先沉淀与营养素结合较强的蛋白，并多次萃取来提高回收率。因此，前处理操作繁琐，步骤多，有机溶剂用量大，耗时且污染较大。

发明内容