[发明专利]一种透明质酸检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种透明质酸检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有HA衍生物的磁微粒，HA结合蛋白，酶标记的HA结合蛋白抗体；

所述HA衍生物由HA的末端羧基与偶联蛋白经EDC-NHS活化偶联而成；

所述试剂盒中各组分如以下方法制得：

步骤1、制备HA衍生物

1.1 BSA偶联前洗涤：在偶联容器中，加入2倍体积的PBS缓冲液，再精确称取3mg BSA，震荡5分钟，混匀后，过滤弃去上清，一次洗涤结束；重复洗涤5次；

1.2 BSA表面活化：将洗涤过的BSA转入小容器中，弃上清加入1.65倍体积的EDC溶液，随即加入1.65倍体积的NHS溶液，震荡混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应2h；

1.3 BSA表面活化：反应结束后，过滤弃去上清，将活化后的BSA再转入大容器中，加入33倍BSA体积的醋酸缓冲液，震荡5分钟，混匀后，过滤弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤2次；

1.4 透明质酸与BSA的偶联：将洗涤过的活化BSA转入小容器中，弃上清后，加入定量的使用醋酸缓冲液稀释到2倍BSA体积的透明质酸，震荡混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应20h；

步骤2、制备结合有HA衍生物的磁性微粒

2.1磁微粒包被前混匀：将磁微粒包装瓶在垂直混合仪或振荡器上混合10-30分钟，使之充分混匀；

2.2磁微粒包被前洗涤：在包被容器中，加入33倍磁微粒原液体积的缓冲液A，再精确吸取30 µL磁微粒，用1ml加样枪反复抽吸混匀后，在多功能搅拌器上搅拌5分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤5次；

2.3磁微粒表面活化：将洗涤过的磁微粒转入小容器中，弃上清加入1.65倍磁微粒原液体积的EDC溶液，随即加入1.65倍磁微粒原液体积的NHS溶液，加样枪反复抽吸混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应2h；

2.4磁微粒表面活化后洗涤：反应结束后，先在磁架分离5分钟，弃去上清，将活化后的磁微粒再转入大容器中，加入33倍磁微粒原液体积的醋酸缓冲液，加样枪反复抽吸混匀后，在多功能搅拌器上搅拌5分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤2次；

2.5磁微粒包被过程：将洗涤过的活化磁微粒转入小容器中，弃上清后，加入定量的使用醋酸缓冲液稀释到3.3倍磁微粒原液体积的HA衍生物，加样枪反复抽吸混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应14-18h；

2.6磁微粒包被后封闭：反应完成后，在磁分离架上磁分离至上清澄清，弃去上清，将包被后的磁微粒转入大容器中，加入33倍磁微粒原液体积的磁微粒封闭保存液，加样枪反复抽吸混匀后，在微型振荡器上振荡10分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复封闭4次；

2.7磁微粒包被后储存：加入100倍磁微粒原液体积的磁微粒封闭保存液，加样枪反复抽吸至底部无磁微粒凝集块，在多功能搅拌器上搅拌均匀后储存于2~8℃待检；

步骤3、制备酶标记的HA结合蛋白抗体

采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶和HA结合蛋白抗体共价偶联在一起，制备成辣根过氧化物酶标记的HA结合蛋白抗体；使用时用以0.01M -1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5%-10%的BSA、鱼明胶、新生牛血清、Casein分别为保护蛋白配制的稀释液稀释至工作浓度而成；

步骤4、制备HA结合蛋白溶液

以0.01M -1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5%-10%的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白，添加HA结合蛋白配制而成；

步骤5、配制透明质酸校准品

以0.01M -1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5%-10%的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白，添加天然纯化或重组的透明质酸抗原配制成0ng/mL、60ng/mL、180ng/mL、360ng/mL、1000ng/mL的系列浓度；

步骤6、配制化学发光底物

发光底物A液为鲁米诺；

发光底物B液为双氧水。

2.根据权利要求1所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径为0.1-10μm。