[发明专利]一种果胶酯酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种果胶酯酶及其制备方法和应用，制备方法包括，将基因工程菌株pEASY‑E1‑243/BL21接种至改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶酯酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量在10‑50kD的酶液；利用该果胶酯酶对高酯果胶的脱酯方法为，将果胶酯酶添加到浓度为10‑12w/v％的高酯果胶溶液中，其添加量为控制活力100‑200U/mL，40‑45℃下酶解2‑3h。本发明所提供的果胶酯酶的制备方法简单，发酵周期短，成本低，且产物含外源酶少；利用其酶解高酯果胶可避免破坏原料中果胶的主链，能获得品质均一的大分子量低酯果胶。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种果胶酯酶及其制备方法和应用。

背景技术

果胶是存在于植物细胞壁中的一种高分子糖类聚合物，其相对分子量介于5×10⁵-30×10⁵之间。通常把酯化度高于50％(相当于甲氧基含量为7％-16.3％)的果胶称为高酯果胶，把酯化度低于50％(相当于甲氧基含量小于7％)的果胶称为低酯果胶。

在食品加工过程中，高酯果胶在糖浓度高于55°Brix和pH值低于3.5的条件下受热能形成凝胶，主要用于高糖食品的生产；低酯果胶只需较低的糖浓度甚至无糖条件下，就能在Ca²⁺或其它二价阳离子体系中形成凝胶。为了满足肥胖和糖尿病等人的需要，低酯果胶可制成低热量的食品，这使低酯果胶的需求量越来越大。

然而，天然低酯果胶来源有限，主要是由高酯果胶在一定条件下通过酶法脱酯、酸法脱酯和碱法脱酯等工艺制备。覃章龙等在2011年报道了传统的酸水解、碱水解均对果胶主链有不同程度的降解，导致果胶分子链缩短，而利用酶法制备低酯果胶具有专一性，明显优于其他方法得到的低酯果胶；杨蕙于2017年比较了不同脱酯方法制备的果胶样品，结果表明，酶法脱酯获得的果胶样品分子链最长，其稀溶液的粘度最大，对大豆蛋白溶液的稳定性效果最好。

酶法脱酯制备低酯果胶的关键是获得优良的果胶酯酶。通常天然微生物产果胶酯酶的同时也产果胶解聚酶，其发酵的粗酶液水解果胶酯键的同时也会在果胶主链的α-1，4-糖苷键发生水解作用或消去作用，缩短了果胶主链。若要用天然微生物发酵生产的果胶酯酶，还需经过纯化分离获得单一果胶酯酶，这一过程新增了生产设备，延长了生产周期，增加生产成本。因此，探索果胶酯酶新的微生物来源和简便的生产工艺势在必行。

随着分子生物学技术的发展，从天然微生物中克隆出果胶酯酶基因，构建基因工程菌株，用于发酵生产特定的果胶酯酶具有重要的实际生产意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种果胶酯酶及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种果胶酯酶的制备方法，包括，将基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21接种至含Amp120μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶酯酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量在10-50kD的酶液，即得；

其中，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.42％-0.58％+胰蛋白胨0.7％-1.2％+酵母提取物0.4％-0.58％+NaCl 0.8％-1.2％，余量为水。

在上述技术方案中，所述IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的添加时间为扩培发酵至OD₆₀₀为0.4-0.6，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.15-1.25mmol/L。

进一步地，在上述技术方案中，所述蛋白酶抑制剂的添加时间为，添加IPTG后，在25-30℃诱导培养12-18h，获得成熟发酵液。

具体地，在上述技术方案中，所述成熟发酵液中的果胶酯酶活力大于500U/mL。