[发明专利]一种染色体非整倍体异常的检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开一种染色体非整倍体异常的检测方法及检测试剂盒。本方法运用全基因组中重复序列(SD,segmental duplication)为检测原理，建立快速准确、操作简单的诊断技术，可同时应用于微滴式数字PCR平台的拷贝数定量分析和多重荧光PCR平台的熔解曲线分析，同步检测多种染色体非整倍体异常。本发明大大缩短了检测周期，具有高灵敏度、高特异性、高通量、低成本、无污染等优点。

技术领域

本发明涉及一种染色体非整倍体异常的检测方法。

背景技术

染色体非整倍体异常是指个体染色体数目不是成倍增加或者减少，而是成单个或几个的增添或减少。目前应用于染色体非整倍体异常检测的技术主要分为细胞遗传学和分子遗传学两大类，其中包括：

1.核型分析(karyotype)：核型分析是基于细胞遗传学的传统诊断方法，通过培养细胞，染色制片等，观察分析等步骤得到核型分析报告。

2.荧光原位杂交(FISH)：由于染色体核型分析存在固有技术缺陷，一系列快速而精确的分子遗传学检测技术迅速发展起来。相较于核型分析，这些分子检测技术均无需培养细胞，一般在取样后12-24h内即可获得分析结果。荧光原位杂交技术(Fluorescence inSitu Hybridization，FISH)利用荧光标记探针与待测染色体的特异序列杂交，从而测定染色体的拷贝数。基本流程包括探针标记、样本及探针变性、杂交、荧光信号采集。FISH检测结果存在固有的局限性，如间期细胞信号分散、不完全杂交、非特异性结合、长时间曝光导致的光漂白、观察者间差等。同时，FISH局限于探针的选择，无法检测罕见结构或数目异常。对于具有争议的FISH结果，仍然需要核型分析作补充。此外，FISH操作繁琐，制片观察、计数过程耗时耗力，需要专业人员操作，不适用高通量筛查。

3.染色体微阵列芯片(CMA)：近年来微阵列比较基因组杂交技术(array-basedComparative Genomic Hybridization，aCGH)也逐渐开始应用于产前诊断。aCGH的原理是将待测样本与正常的对照样本用不同荧光标记后，竞争杂交位于芯片上的基因组探针，最后利用芯片扫描仪获得荧光信号，通过分析两个不同荧光信号的比例来确定拷贝数比例，从而检测染色体数目。比起上述几种受限于探针的选择而只能检测特定染色体异常的技术，aCGH 能检测全基因组范围的非整倍体、微缺失、微重复综合征等一些精细的基因变异，但aCGH 无法检测单倍体、多倍体及平衡易位或倒位。此外，aCGH的检测效率还受到拷贝数变异、杂交效率、等位基因脱扣和优先扩增等现象的影响。

4.多重连接探针扩增(MLPA)：多重连接依赖探针扩增技术(Multiplex LigationDependent Probe Amplification，MLPA)以PCR为基础，根据染色体特异序列设计探针，每组包括一长一短两条探针，各自包含一段通用引物序列与一段相邻的染色体特异序列，长探针在两段序列间添加了一段长度不同的噬菌体来源填充序列。当两条探针与DNA完全匹配时，可被连接酶连接成为一条完整的可被通用引物扩增的序列。扩增产物经毛细管电泳分析，得到荧光信号，其相对峰面积与目的基因的数量成比例。MLPA的多重检测一次可检测40个位点，适合高通量检测，且灵敏度高，可识别单核苷酸位点异常。但MLPA探针制备繁琐，不仅需要基因克隆、病毒转染、质粒提取和酶切等过程，还必须购买一套昂贵的SALSA载体。同时， MLPA需要PCR后毛细管电泳对产物进行定量分析，开盖易造成样本间交叉污染，通量较低、成本较高。

5.实时荧光定量PCR(qPCR)：qPCR在拷贝数变异、染色体非整倍体异常的定量检测上发挥着重要的作用。多篇文献报道的研究中将qPCR应用到染色体非整倍体的检测当中，它的检测原理是用两对不同的引物分别扩增待测染色体上的序列和参照染色体上的序列，然后用两条标记不同荧光基团的探针来检测两种扩增片段，对比Ct值的差异情况就能判断出待测染色体的数目异常情况。此方法缺陷在于不同引物对的扩增效率不一定相同，导致Ct值误差可能比较大，而且对检测样本质量也有较高的要求。