[发明专利]乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌的快速定量检测方法及试剂盒

说明书

一种乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌的快速灵敏定量检测方法及试剂盒。采用特异性免疫荧光抗体标记金黄色葡萄球菌，并辅以膜选择通透性荧光材料来标记区分死菌和活菌，再进行流式分析技术检测，通过计数不同荧光信号，根据本发明得到的金黄色葡萄球菌在乳品中培养增菌的数学公式，计算得到乳制品中金黄色葡萄球菌活菌的浓度。本发明的试剂盒具有准确定量、特异性强、灵敏度高、检测时间短、可区分死活菌的优点。

技术领域：

本发明属于食品微生物检测领域，涉及乳品中痕量金黄色葡萄球菌的快速灵敏定量检测方法及试剂盒。

背景技术：

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。GB 29921-2013《食品中致病菌限量》中金黄色葡萄球菌作出来明确规定，限量为100CFU/g(mL)。因此能够快速准确的定量检测出食品和水中金黄色葡萄球菌活菌，对食品安全和保障人民健康具有非常重要的意义。

传统培养法检测金黄色葡萄球菌耗时费力，需要54小时以上时间才能完成检测。

现有的的快速检测技术存在以下缺点：

1、不能区分死菌和活菌

众所周知，只有活菌才有致病性，因此如果不清楚活菌量，即使是定量检测，也很难估计该菌的感染程度。

但目前国内外主流技术，包括免疫学方法、分子生物学方法、液相芯片法和流式计数法等。不仅检测时间仍然较长，而且难以区分死活菌。

因为，免疫学方法是通过抗原抗体相互反应的原理，它只能检测总的细菌抗原蛋白；而分子生物学方法是通过基因扩增原理，只能检测总的细菌核酸；液相芯片法是通过抗体捕获细菌抗原再通过抗体标记抗原进行检测，只能检测得出细菌表面抗原浓度；先前建立的流式计数法只能通过抗体捕获细菌，再通过细菌核酸染料进行标记，只能检测得到总的细菌浓度。以上方法均不能区分死菌和活菌。

2、检测灵敏度达不到要求

国标中要求乳品中金黄色葡萄球菌限量为10～100CFU/mL(g)，现有液相芯片法和流式计数法的检测限都在103CFU/mL以上，无法满足检测的基本需要。

比如，中国专利CN201711457774.7，用微滴数字PCR快速检测纯培养的金黄色葡萄球菌，将金黄色葡萄球菌阳性成分DNA为模板，按照微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌阳性基因有明显扩增，且扩增终点荧光信号大于或等于阈值记为阳性拷贝，根据阳性拷贝数值判定结果，实现对金黄色葡萄球菌的检测。但是，该方法检测到的金黄色葡萄球菌是死菌和活菌的总浓度。此外，该专利的检测限是10³CFU/mL，却无法检出低浓度的细菌。

因此，快速定量检测，灵敏度高(检测限达到10CFU/mL(g))，且能检出活菌数，是金黄色葡萄球菌的实际需要，也是技术难点。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速定量检测方法，即，该方法必须能够区分死活菌，且检测限可以达到10CFU/mL(g)的灵敏程度。

本文所称的“乳品”，包括乳及乳制品。

本发明的第二目的是提供一种快速定量检测乳品中金黄色葡萄球菌的试剂盒。

本方法具有两个技术关键点：一是如何特异地识别痕量金黄色葡萄球菌，二是如何准确区分金黄色葡萄球菌死活菌。

针对上述问题，本发明人进行了如下工作：