[发明专利]辅因子-底物探针平台用于肿瘤缺氧相关酶的快速定量检测

说明书

辅因子‑底物探针平台用于肿瘤缺氧相关酶的快速定量检测，其属于有机‑金属超分子、生物无机和生物荧光探针领域。本发明致力于新型超分子探针开发和生物应用的研究，首次提出了辅因子模拟物和底物的融合策略，使酶催化双底物过程简化为单底物过程。使得传统依赖于辅因子浓度的荧光传感器不再受辅因子干扰，对目标酶的检测具有超快荧光信号响应。更重要的是由于不依赖辅因子，因此辅因子‑底物探针的荧光强度与目标酶含量线性相关。该辅因子‑荧光底物融合策略为新型快速定量检测缺氧酶提供了有效的工具，为生物示踪、疾病诊断等提供了新方法。

技术领域

本发明属于金属-有机超分子、生物无机和生物荧光探针领域，具体涉及用于快速定量检测缺氧酶的主-客体超分子探针的制备方法及在溶液、细胞、活体检测方面的应用。

背景技术

缺氧是许多癌症的一项重要指标，与肿瘤的各种生理活动密切相关。目前，许多基于底物的酶促荧光探针通过使用靶向低氧激活的方法鉴定癌细胞中低氧酶的位置和表达水平，用于溶液、癌细胞和小动物体内低氧酶异常水平的检测和成像，对癌症的早期诊断和监测治疗至关重要。然而，缺氧酶的浓度和表达水平通常在不同的细胞和肿瘤中差别很大，甚至相同的细胞中也有差异。当一定量的传统探针用于检测时，未知浓度的辅因子和酶两个变量都会导致探针发射随时间发生显着变化，传统探针很难排除辅因子浓度对检测结果的干扰，酶含量与荧光响应没有显示出稳定的线性关系。因此，传统的探针方法来定量检测酶含量，准确区分正常和疾病状态的酶活性变化仍然是一项具有挑战性的课题。

对于传统的探针来说其对体内缺氧酶含量的检测高度依赖于辅因子的含量，通常在溶剂检测辅因子依赖性的缺氧酶实验中，研究人员通过加入大量过量(几十倍到几百倍摩尔量)的辅因子，从而消除酶催化反应中辅因子浓度干扰，使得辅因子浓度相控制不再制约缺氧酶催化底物的最大反应速率，响应信号只与酶含量相关。这种方法消除了辅因子的浓度对酶催化探针荧光开启速率的限制，以实现精确、快速的检测。但是细胞中检测时，不同种类的细胞，甚至在具有不同缺氧条件的相同细胞中，缺氧酶和相应辅因子的表达水平是不固定的，而且也无法实现溶剂实验中辅因子大大过量的条件。因此，将基于辅因子-底物的探针组合到一个超分子系统中，该体系中辅因子和底物两者之间具有明确的化学计量比，并且相互接近的主客体分子将促进电子转移效率，这将使探针与酶的反应速率不被内源辅因子浓度干扰，对于快速定量检测很有帮助。

金属-有机多面体笼具有酶高效催化底物转化的能力，研究人员使用具有特定亲-疏水腔的金属-有机笼作为独特的主体来催化化学转化。将辅因子模拟物直接引入到金属-有机笼状配合物的骨架中，使催化活性位点靠近底物，并促进反应物之间有效的电子转移过程。将基于酶底物的发光探针封装在辅因子组装的“分子容器”中，得到一种可用于区分和定量检测正常状态和疾病状态下不同酶活性的重要工具。这种新型辅因子-底物结构的主-客体超分子探针融合策略使发光底物、辅因子和酶的氧化还原反应能够有效发生，表现出出色的动力学特性。

发明内容

本发明的目的是提出一种基于辅因子-底物探针平台用于肿瘤缺氧相关酶的快速定量检测，包括其制备方法和生物测试应用，金属-有机笼状配合物作为NADH模拟物与底物融合成准分子与酶催化反应，将多底物反应变为单底物反应的策略。通过减少底物种类，缩短各底物之间距离，促进反应动力学改变。

本发明的技术方案如下：

基于辅因子-底物探针平台结构、基本配体组成单元及酶催化反应，如图1所示。