[发明专利]辅因子-底物探针平台用于肿瘤缺氧相关酶的快速定量检测

权利要求书

1.一种用于组装NADH模拟物金属-有机笼状配合物的二氢吡啶配体，其特征在于：该配体为式I所示化合物：

其中：

R₁采用2-吡啶基、2-吡咯、喹啉或异喹啉；R₂为苯基。

2.根据权利要求1所述的二氢吡啶配体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以丙炔酸甲酯、R₂-CHO、醋酸铵和冰醋酸为原料制备中间体1所示化合物；

所述醋酸铵：丙炔酸甲酯：R₂-CHO的摩尔比为4:2:1；

(2)以所示中间体1、4-(2-氯乙基)吗啉、碱、有机溶剂为原料制备中间体2所示化合物；

所述碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯或有机碱；所述有机溶剂选自丙酮、N,N-二甲基甲酰胺或1,4-二氧六环；所述中间体1：4-(2-氯乙基)吗啉的摩尔比为1:1.1；所述中间体1：碱的摩尔比为1:2-4；

(3)以中间体2和80％水合肼反应，得到中间体3所示化合物；

中间体2与80％水合肼的摩尔比1:5-10；

(4)以中间体3和R₁-CHO在醋酸催化下反应，得到式I化合物；所述中间体3：R₁-CHO的摩尔比1:2。

3.根据权利要求1所述的二氢吡啶配体组装得到的NADH模拟物金属-有机笼状配合物，其特征在于：所述二氢吡啶配体与金属离子组装得到的M₃N₃型NADH模拟物金属-有机笼状配合物，M为金属离子，N为二氢吡啶配体。

4.根据权利要求3所述的NADH模拟物金属-有机笼状配合物装配的辅因子-底物探针平台，其特征在于：所述探针平台采用NADH模拟物金属-有机笼状配合物作为主体部分，硝基还原酶荧光底物作为客体部分，辅因子-底物探针平台由NADH模拟物金属-有机笼状配合物和硝基还原酶荧光底物组装得到，NADH模拟物金属-有机笼状配合物与硝基还原酶荧光底物的摩尔比为1:1；

所述硝基还原酶荧光底物为式Ⅱ或式Ⅲ的结构，硝基还原酶荧光底物的制备方法为：

其中：R₃采用2-苯基-3a，11b-二氢-1H-菲[9,10-d]咪唑基、萘基、喹喔啉基、卟啉基或卟吩基；

采用R₃-OH或R₃-NH₂与对硝基苄氯为原料，合成式Ⅱ或式Ⅲ的结构，作为硝基还原酶荧光底物。

5.根据权利要求4所述的NADH模拟物金属-有机笼状配合物装配的辅因子-底物探针平台的制备方法，其特征在于：

(1)将权利要求1所述的二氢吡啶配体与所需配位金属盐分别溶于有机溶剂中，将两种溶液充分混合搅拌，通过溶剂挥发结晶、溶剂扩散结晶或加入小极性互溶溶剂沉淀出NADH模拟物金属-有机笼状配合物，通过核磁、质谱或单晶结构确认结构M₃N₃，M为金属离子，N为二氢吡啶配体；

(2)将上述NADH模拟物金属-有机笼状配合物和硝基还原酶荧光底物混合，得到辅因子-底物探针平台。

6.根据权利要求4所述的NADH模拟物金属-有机笼状配合物装配的辅因子-底物探针平台的应用，其特征在于：NADH模拟物金属-有机笼状配合物与硝基还原酶荧光底物融合成辅因子-底物探针平台应用于硝基还原酶的定量检测。

7.根据权利要求6所述的NADH模拟物金属-有机笼状配合物装配的辅因子-底物探针平台的应用，其特征在于：所述辅因子-底物探针平台应用于溶剂中的硝基还原酶的定量检测，向辅因子-底物探针平台的Tris-HCl缓冲液中加入硝基还原酶0-5μg/mL进行荧光滴定实验和荧光动力学实验。