[发明专利]一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法

说明书

一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。该方法包括：垫状卷柏无菌外植体的获得、原生芽的诱导、不定芽的增殖以及组培苗壮苗和生根培养。本发明成功以复苏植物垫状卷柏幼嫩枝条尖端为外植体，构建了垫状卷柏组培繁殖体系，不定芽的增殖率达8倍以上，组培苗壮苗和生根培养过程中的单个不定芽的再次增殖率达11倍以上，1个垫状卷柏幼嫩枝条尖端在170～175天内可以扩繁得到88株以上的组培苗，获得了较高的繁殖效率，为垫状卷柏的规模化扩繁奠定了良好的基础，对复苏植物垫状卷柏的野生种群保护和资源开发利用具有重要意义。

技术领域

本发明属植物繁殖领域，具体涉及一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。

背景技术

垫状卷柏[Selaginella pulvinata(Hook.Grev)Maxim.]，隶属于卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属，呈垫状，主茎不呈匍匐状，主要生长于裸露的石灰岩表面或石缝，生长环境较为干旱。垫状卷柏俗称“九死还魂草”，是典型的复苏植物，具有极强的耐脱水特性，能在极端脱水的情况下通过较低的新陈代谢保持长期生存，水分条件适宜时，能迅速恢复正常生长。垫状卷柏因其神奇的复苏特性成为一类特殊的观赏植物资源。同时，垫状卷柏含有黄酮、双黄酮、炔酚等药用成分，具有抗癌、抗病毒、抗氧化和降糖等功效，是重要的药用植物资源。

垫状卷柏为异形孢子蕨类，具有大孢子和小孢子，在湿润环境中，大孢子发育成为具有颈卵器的雌配子体，小孢子发育成为具有精子器的雄配子体，在水环境下，精子器中的精子进入颈卵器中，与卵子结合形成受精卵，最终发育成为垫状卷柏幼苗。然而，垫状卷柏的生境较为干旱，仅雨季有短暂的湿润期，不利于垫状卷柏的孢子繁殖，难以形成孢子繁殖后代。连续野外调查发现，垫状卷柏野外种群的自然繁殖率较低，种群内的个体数量没有明显增加。加之垫状卷柏兼具观赏和药用价值，野生资源被大肆采掘，导致垫状卷柏野外种群数量急剧减少，野生资源已经无法满足当前的需求。

卷柏属中，部分主茎匍匐状的种类，如：小翠云，茎节处具有不定根，可以进行扦插繁殖，但垫状卷柏的主茎不呈匍匐状，极难进行扦插繁殖。此外，在前期研究中发现，垫状卷柏组培过程中极容易产生褐化，组培繁殖难度较大。目前，尚未见关于复苏植物垫状卷柏相关繁殖技术的报道，亦未见复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。

发明内容

为解决复苏植物垫状卷柏野生种群急剧减少、自然繁殖力低等问题，本发明提供一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法。

本发明所述的一种复苏植物垫状卷柏的组培繁殖方法，包括以下步骤：

(1)无菌外植体的获得

选取野生垫状卷柏植株的幼嫩枝条尖端作为外植体，经过消毒灭菌后，获得无菌外植体；

(2)原生芽的诱导

将步骤(1)中获得的无菌外植体接种在原生芽诱导培养基上，放置于20～25℃培养室中进行暗培养，暗培养周期为30～45天，所述原生芽诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.1～0.2mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+柠檬酸400～500mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(3)不定芽的增殖

将步骤(2)中获得的原生芽接种在不定芽增殖培养基上，放置于培养室中进行增殖培养，增殖培养的周期为50～60天，所述不定芽增殖培养基为：1/2MS+6-BA 0.8～1.0mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；所述增殖培养环境条件为：20～25℃,光照强度为30～40μmol·m^-2·s^-1，每天光照时间为16小时；

(4)组培苗壮苗和生根培养